16种具有P-gp抑制作用的上市药物对吉非替尼口服生物利用度和脑通透性的影响

吴延庆，曹青青，张 婷，翟 宇，李文萍，杨 劲

(中国药科大学药物代谢与动力学研究中心，南京 210009)

肺癌中约有85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中30%～50%的NSCLC患者在疾病进展过程中，会发生脑转移[1-2]。吉非替尼是一种选择性EGFR络氨酸激酶抑制剂，作为局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者的单药治疗，对NSCLC患者有较好的疗效[3]，但是对于脑转移患者效果不够理想[3]。吉非替尼是P-gp和BCRP的底物(其中P-gp是主要的转运体)，脑通透性低，脑暴露量小，如果提高脑内暴露水平可能会提高脑转移患者的疗效[4]。临床前研究发现抑制P-gp和BCRP能够显著提高吉非替尼的脑通透性，增加脑暴露量[5]，但对于具有P-gp抑制作用的上市药物对吉非替尼的口服生物利用度和脑通透性的影响尚不明确，本文研究了具有P-gp抑制作用的上市药物对吉非替尼的口服生物利用度和脑通透性的影响，探究其是否能够特异性提高脑组织暴露量。

1 材 料

1.1 药品与试剂

吉非替尼、厄洛替尼、16种具有P-gp抑制作用的上市药物(见表1，南京生利德生物技术有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(纯度99.0%，美国Roe公司)；超纯水，实验室自制，由UPH-Ⅱ-5优普超纯水制造系统制造。

DrugDose/(mg/kg)AUCplasma/(ng/mL·h)AUCbrain/(ng/mL·h)Kptcmax,plasma/(ng/mL)cmax,brain/(ng/mL)[I]/(nmol/L)[I]/[IC50]Ritonavir*120,twice daily70 63010 7960.158 500±1 350.001 232±131.6410.760.47Dronedarone*80,twice daily39 840.674 342.750.115 795±2 734.84528.4±49.044.610.20Propafenone*85,twice daily38 558.177 100.80.184 515±1 373.98898±401.617.840.34Verapamil*16,twice daily36 781.836 206.50.174 423.33±1 561.93720.6±345.266.290.27Omeprazole8,once daily32 975.676 514.540.24 798.33±2 136.53944.6±327.738.250.36Carvedilol*5,twice daily32 465.674 741.30.154 141.67±500.86605.2±249.075.280.23Lopinavir*80,twice daily32 416.174 408.60.144 806.67±1 467.12835±228.917.290.32Ranolazine*200,twice daily31 910.53 831.90.123 915±942.83377.4±165.023.290.14Diltiazem84,once daily28 620.336 6730.233 620±2 744.23914.4±371.657.980.35Clarithromy-cin*100,twice daily27 916.675 787.20.213 506.67±300.89779±164.166.800.30Quinidine*2,twice daily27 763.833 063.90.114 348.33±1 268.88523.8±141.174.570.20Captopril10,twice daily23 0193 587.30.163 208.33±587.59460.6±96.044.020.17Itraconazole*40,twice daily22 868.673 4200.153 120±510.69463.4±199.454.050.18Gefitinib50,-21 840.175 424.10.253 513.33±984.75712.6±333.806.220.27Telmisartan16,twice daily21 7953 257.50.152 542.67±1 289.81418.6±192.163.650.16Felodipine2,twice daily16 716.672 744.740.161 926.67±1 224.26274.4±159.332.400.10Rifampicin120,once daily6 776.671 854.150.271 225.17±736.44257.6±52.382.250.10

*Drugs recommended by FDA

1.2 仪 器

高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，含以下部件：DGu20A3在线脱气系统、SIL20AC自动进样器、LC20AD二元梯度泵、CTO20A柱温箱；API4000三重四极杆质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，含色谱工作站Analyst 1.5.2；3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；UPH-Ⅱ-5优普超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司)。

1.3 动 物

雄性SPF级ICR小白鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司公司提供，许可证号SCXK(沪)2018-0006，体重30 g左右。饲养温度为25 ℃，实验前禁食12 h，饮水自由。

2 方 法

2.1 抑制剂的选择

主要选择了FDA在药物研发和药物相互作用文件推荐的具有P-gp抑制作用的上市药物[6]，同时选择了一些其他非FDA推荐的具有P-gp抑制作用的上市药物[7]，见表1。

2.2 动物实验

药物均用CMC-Na配制成混悬液(维拉帕米不溶于CMC-Na除外，配成水溶液)，均为灌胃给药，给药体积为10 μL/g。

204只ICR小鼠随机分为17组，每组12只，4个时间点，每个时间点3只小鼠，抑制剂先连续给药6 d，消除潜在的时间依赖效应，在第7天，对照组同时给予吉非替尼和CMC-Na溶液，抑制剂组同时给予吉非替尼混悬液和16种抑制剂混悬液，其中给药剂量及给药间隔参考FDA药品使用说明书，动物给药剂量由人体给药剂量换算得到[8]。对照组和抑制剂组均于给药后1，3，6，12 h眼眶静脉取血后迅速离心获得血浆样品，处死并取出脑组织，称取脑组织0.3 g按1∶2用生理盐水匀浆得到脑匀浆样品。

2.3 样品处理方法

血浆样品前处理方法，取血浆100 μL，加入内标10 μL，再加入乙腈500 μL沉淀，漩涡3 min后离心，取上清液100 μL放入进样小瓶，进样10 μL用LC-MS/MS检测。

脑匀浆样品处理方法，取脑匀浆100 μL，加入内标10 μL，再加入乙腈沉淀，漩涡3 min后离心，取上清液100 μL放入进样小瓶，进样10 μL用LC-MS/MS检测。

2.4 色谱和质谱条件

色谱柱为Phenomenex Synergi Fushion-RP 80 Å色谱柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)，柱温为40 ℃，自动进样器温度为4 ℃，进样量为10 μL；水相为0.1%甲酸-5 mmol甲酸铵-水溶液，流速为0.4 mL/min，有机相为乙腈，流速为0.6 mL/min，洗脱程序为等度洗脱，总时长5 min。

采用电喷雾离子化电离源(ESI源)，正离子模式下的多反应检测(MRM)，吉非替尼的质谱参数，检测离子对为447.2→128.1，喷雾电压IS为5 500 V，雾化温度TEM为450 ℃，碰撞气CAD为10 psi(1 psi=6.895 kPa)，气帘气CUR为12 psi，离雾化气GS1为60 psi，辅助气GS2为60 psi，去簇电压DP为53 V，碰撞能量CE为31.5 eV，碰撞室射出电压CXP为12 V，射入电压EP为10 V；厄洛替尼的去簇电压DP为95 V，碰撞能量CE为42 eV，碰撞室射出电压CXP为9 V。

2.5 药代动力学参数的计算

血浆和脑匀浆AUC及cmax由WinNonlin 6.2软件使用非房室模型的统计矩方法计算。

组织分配系数:Kpt=AUCbrain/AUCplasma。

本研究计算出的药代动力学参数输入到开源软件R语言中绘图，使用版本为3.5.1。

3 结 果

3.1 方法学验证结果

3.1.1 专属性 在本实验色谱和质谱条件下，内源性物质对吉非替尼和内标厄洛替尼均没有干扰，空白基线稳定不存在其他杂峰，吉非替尼和内标的保留时间分别为2.77和2.96 min，方法具有较好的专属性，见图1。

Figure1 LC-MS/MS chromatograms of gefitinib (left) and erlotinib (IS,right)
A-B:Blank plasma;C-D:LLOQ (2 ng);E-F:Pplasma sample (3 h) of control group

3.1.2 标准曲线及定量下限 配制质量浓度为2，5，10，20，50，100，200 ng/mL的吉非替尼标准含药血浆，按血浆样品前处理方法处理，LC-MS/MS分析，以吉非替尼峰面积和内标峰面积的比值y为纵坐标,理论浓度x为横坐标，做线性回归(权重系数为1/x)，得到标准曲线y=0.078 4x+0.165。平行配制6份定量下限吉非替尼标准含药血浆，LC-MS/MS分析，计算吉非替尼峰面积和内标峰面积的比值，带入标准曲线，计算实际浓度。吉非替尼的线性范围为2～200 ng/mL，定量下限为2 ng/mL(n=6，相对标准偏差RSD=8.03%)。

3.1.3 准确度和精密度 配制质量浓度为4，75，150 ng/mL的低中高质控标准含药血浆，按血浆样品前处理方法处理，LC-MS/MS分析，计算吉非替尼峰面积和内标峰面积的比值，带入当天随行标准曲线，计算实际浓度。每天处理一批，处理3 d，计算准确度、批内精密度和批间精密度。准确度、批内精密度和批间精密度RSD均在15%以内，符合准确度和精密度要求。

3.1.4 稳定性 考察了工作液和储备液室温放置4 h和避光4 ℃放置30 d的稳定性，血浆样品室温放置4 h、进样架放置24 h、-20 ℃反复冻融3次的稳定性，以及-20 ℃冻融30 d的稳定性，RSD均在15%以内，符合稳定性要求。

3.1.5 基质效应和提取回收率 精密移取质控工作液10 μL和内标工作液10 μL，再加入乙腈600 μL，涡旋3 min，配成质量浓度为4，75，150 ng/mL的标准溶液，相同浓度平行配制6份。取100 μL于进样小瓶中，用LC-MS/MS分析，记录吉非替尼峰面积与内标峰面积，记作A。

精密移取质控工作液10 μL和内标工作液10 μL，再加入空白提取液600 μL，涡旋3 min，配成质量浓度为4，75，150 ng/mL的标准溶液。相同浓度平行配制6份。取100 μL于进样小瓶中，用LC-MS/MS分析，记录吉非替尼峰面积与内标峰面积，记作B。

精密移取质控工作液10 μL和内标工作液10 μL，加入空白血浆100 μL，再加入乙腈500 μL，涡旋3 min，配成质量浓度为4，75，150 ng/mL的标准含药血浆。相同浓度平行配制6份，按血浆样品前处理方法处理，取100 μL于进样小瓶中，用LC-MS/MS分析，记录吉非替尼峰面积与内标峰面积，记作C。

通过基质效应计算公式：ME=B/A×100%，计算得到平均基质效应为77%，说明基质对吉非替尼有抑制作用；提取回收率R=D/C×100%，计算得到的平均提取回收率为(105±7)%，说明提取过程对样品测定没有影响。

3.1.6 稀释效应 配制质量浓度为500 ng/mL的标准含药血浆，用空白基质稀释100倍，按血浆样品前处理操作，用LC-MS/MS分析，计算吉非替尼峰面积和内标峰面积的比值，带入当天随行标准曲线，计算实测浓度。实测浓度/理论浓度×100%在85%～115%之间，说明用空白基质稀释对样品测定没有影响。

3.2 血药浓度-时间曲线和血浆AUC

对照组和抑制剂组的血药浓度-时间曲线见图2，血浆AUC见图3，对照组和抑制剂组的AUC及cmax见表1。其中吉非替尼代表对照组(给予吉非替尼和CMC-Na，表示为黑色)，其他为抑制剂组(给予吉非替尼和抑制剂，表示为灰色)，从血浆AUC中可以看出利托那韦能够增加吉非替尼的血浆药物浓度，给予利托那韦的血浆AUC是对照组的3.2倍。利福平能够降低吉非替尼的血药浓度。

3.3 脑药浓度-时间曲线和脑匀浆AUC

对照组和抑制剂组的脑匀浆浓度-时间曲线见图4，脑匀浆AUC见图5，对照组和抑制剂组的AUC及cmax见表1，其中吉非替尼为对照组(表示为黑色)，其他为抑制剂组(表示为灰色)，从脑匀浆AUC中可以看出利托那韦能够增加吉非替尼的脑药物浓度，给予利托那韦的脑AUC是对照组的2倍。给予利福平能够降低吉非替尼的脑药物浓度。

3.4 脑组织分配系数

脑组织分配系数(Kpt)见表1，由组织分配系数可以发现，给予具有P-gp抑制作用的上市药物后，虽然能增加血浆暴露量但不能特异地增加脑暴露量，组织分配系数没有增加。

3.5 脑药物游离分数校正脑药物浓度

只有游离药物才能发挥药效，为了分析吉非替尼脑药物浓度和脑肿瘤生长的关系，用游离分数校正了脑部药物浓度，其中脑游离分数为fubrain为0.39%[9]，游离药物浓度为[I]，并和吉非替尼体外的PC-9细胞IC50(人NSCLC 19外显子突变细胞，IC50=23 nmol/L)[10]做了对比，发现对照组[I]/[IC50]为0.27，给予利托那韦后增加为0.47，见表1。

Figure3Area under plasma concentration-time curves of gefitinib after oral dose of gefitinib with CMC-Na (black bars) or clinical P-glycoprotein inhibitors (grey bars).The area between the two dotted lines indicates 80%-125% of the AUC of the control group.Results are presented as mean (4 times points for each group,n=3)

Figure5Area under brain concentration-time curves of gefitinib after oral dose of gefitinib with CMC-Na (black bars) or clinical P-glycoprotein inhibitors (grey bars).The area between the two dotted lines indicates 80%-125% of the AUC of the control group.Results are presented as mean (4 times points for each group,n=3)

4 讨 论

吉非替尼是P-gp和BCRP的底物(其中P-gp是主要的转运体)，脑通透性低，临床前研究发现抑制P-gp和BCRP能够显著提高吉非替尼的脑通透性，增加吉非替尼的脑暴露量，文献报道了给予特异性抑制剂Elacrider后，吉非替尼脑通透性增加了4倍[5]；但是特异性抑制剂由于安全性问题，不能联合使用。本文研究了16种具有P-gp抑制作用的上市药物对吉非替尼口服生物利用度和脑通透性的影响。研究发现，利托那韦能够增加吉非替尼的口服生物利用度，可能的解释是吉非替尼是CYP3A4的底物，利托那韦是CYP3A4的强抑制剂，能够降低吉非替尼的代谢，但利托那韦不能增加吉非替尼的脑通透性。而利福平是CYP3A4的强诱导剂，能够增加吉非替尼的代谢，降低吉非替尼的口服生物利用度，和文献报道的利福平能够降低吉非替尼口服生物利用度相符[11]。其中部分抑制剂对血浆AUC和脑内药物AUC变化的影响不一致，其原因可能是小鼠的个体间差异导致。临床剂量的具有P-gp抑制作用的上市药物虽然能够提高血药浓度，但是脑组织浓度并没有特异性增加，组织分配系数没有增加，说明在临床剂量下，这16种具有P-gp抑制作用的上市药物不足以抑制脑部P-gp，需要研究特异性更好和更安全的P-gp抑制剂。用脑游离分数校正吉非替尼脑内浓度，并和体外PC-9细胞的IC50进行比较，发现对照组[I]/[ IC50]为0.27，本研究结果发现，脑部药物暴露量不足可能是吉非替尼治疗脑部肿瘤转移疗效不理想的原因之一。