土壤中砷形态提取和分析的条件改进

安礼航，陈 阳，陈志良，刘浩辉，刘敏超，张建强

(1.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529020；2.环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655；3.广东省农田重金属污染土壤治理与修复工程技术研究中心，广东 广州 510655)

1 引言

砷(As)是世界范围内农田重金属污染的主要元素之一，尤其在中国、孟加拉国、美国等地[1～3]。不同形态的砷的毒性有很大的差异，一般来说，无机砷毒性大于有机砷，三价砷毒性是五价砷的60倍[4]。准确地分析土壤和沉积物中各形态砷的含量是评价土壤中砷元素的生物毒性及危害程度的必要条件。

此外，据报道超声波提取优于离心提取和振荡提取[15]，但白云飞等[16]使用超声提取获得的提取率最高只有49.46%。张静[17]发现使用100 ℃水浴提取其提取率可达79%，同时超声萃取只有51%。这说明水浴比超声的提取效率更高，然而许多研究提取率普遍未超过80%，因此提取方法有待进一步改进与优化。

综上所述，本研究拟改进原有的砷提取方法，采用不同配比的磷酸混合盐酸作为砷提取溶剂，发挥彼此的优势和互补性，同时比较了提取剂在不同浓度条件下以及不同的辅助提取手段下的提取效率。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

AFS-52型原子荧光光谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；TGL-15B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；HNY-1102C型水浴恒温振荡器(上海百典仪器设备有限公司)；MIX30S型涡旋混合仪(广州围谷润仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水仪(广州东锐科技有限公司)。

三价砷标准溶液：取砷(As3+)标准溶液(广州博纳仪器有限公司)一定量，用(1+9)盐酸溶液准确稀释成含砷(As)1.00 mg/L的标准工作溶液。吸取含砷(As)1.00 mg/L的标准工作溶液2.50 mL于25 mL比色管中，加5 mL(1+1)盐酸溶液摇匀，加6 mL硫脉一抗坏血酸溶液，加水至刻度，充分摇匀，即为含砷(As)100 μg/ L的标准系列溶液。

五价砷标准溶液：在5.0 mL As (Ⅲ)标液(1000 mg/L)中加入5.0 mL 22% H2O2，然后定容至100 mL，2 h后，即为50 mg/L As(V)的标液，其余不同含量As(V)的标准配制方法与此类似。

硫脲-抗坏血酸溶液：称取12.5 g硫脲、12.5 g抗坏血酸溶解定容至250 mL，用时现配。

2.2 土壤样品

实验所用的土壤标准样品来自中国地质科学院地球物理化学勘察研究所认证的泛滥平原沉积物成分分析标准物质，有淮河底泥(GSS-32)，黄河底泥(GSS-33)和黑龙江底泥(GSS-35)，样品具有良好的均一性和粒度分布。

2.3 实验方法

准确称取0.20 g样品，放人15 mL离心管中，加入适量的提取剂，涡旋混匀后按照正交设计方案在规定的时间内进行提取，然后在6000 r/min下离心分离20 min，取上层清液过0.25 m滤膜后用一定的量的盐酸酸化，加入一定量的硫脲-抗坏血酸溶液还原，混匀定容，1 h后用原子荧光测定(总砷)。所有样品均设置三个平行。

As(Ⅲ)的测定：取上述提取液3 mL于分液漏斗中，加入20 mL 10 mol/L的HCl，再加3 mL浓HCl，保证酸的浓度达到9 mol/L以上以便完全萃取As(Ⅲ)[18]。使用氯仿萃取As(Ⅲ)，共萃取4次，每次加入3 mL，保留有机相。再用水将As(Ⅲ)从有机相中反萃取出来，反萃取2次，每次加5 mL水，保留水相，定容测定。同时做试剂空白。

As(V)的测定：用总砷含量差减法得到As(V)含量。

3 结果与讨论

3.1 仪器工作条件的选择

经多次试验，选出峰形良好且无干扰的仪器最佳工作条件为，通道灯电流：主灯40 mA，辅灯40 mA；负高压280 V；载气流量300 mL/min；屏蔽气流量：900 mL/min；原子化器高度8 mm；原子化器温度200 ℃。

3.2 提取剂与提取时间的选择

本实验以磷酸混合盐酸为提取剂，对土壤中不同形态的砷进行提取。采用正交实验设计的方法，在减少实验量的同时能够得出影响砷形态提取的主要因素，获得最佳的提取条件。采用L16(45)正交水平表进行实验，以提取所得的总砷含量为监控指标，考查提取剂浓度(1.5，3，5，8 mol/L)、提取剂比例(磷酸和盐酸的比例分别为1∶1，2∶1，1∶4，4∶1)、提取时间(10，30，60，90 min)3种因素对提取结果的影响。称取0.20 g土于15 mL离心管中，加提取剂8 mL，按2.2节实验方法和表1 中设计的实验方案进行提取和测定，提取结果见表1，利用极差分析进行主要影响因素和最佳提取条件的确定，结果见表2和图1。

表1 提取剂与提取时间的正交实验结果

表2 正交实验极差分析

图1 萃取剂和萃取时间的效应曲线

由表2和图1正交实验极差分析结果可知：RA>RB>RC，即影响提取效果的因素顺序为：提取剂浓度>提取剂比例>提取时间。极差结果表明，磷酸与盐酸的混合浓度是影响提取效果的主要因素，当总浓度从1.5 mol/L提高到8 mol/L时，提取率大幅下降。实验过程中发现当提取剂总浓度过高时(≥5 mol/L)会产生较大的试剂空白值，研究表明[19]，磷酸在较高浓度时其氧化性随之增强，导致空白值也随之增大，且较难控制提取过程中砷形态不发生转化。因此在不影响提取率的条件下，提取剂总浓度不宜过高。其次是提取剂的比例，随着磷酸组分的比例增大，提取率显著增加，当比例为4∶1时提取率最高，说明磷酸比盐酸有更好的提取效率，这与前人的研究结果有所不同；延长提取时间，提取率经历先增加后降低的趋势，提取时间为60 min时提取率最高。

综合以上结果表明，最佳的提取剂的比例为磷酸与盐酸4∶1，总浓度为1.5 mol/L，提取时间为60 min。经试验，在该条件下，提取率可达57.98%。

3.3 提取条件与提取次数的选择

在上述最佳提取剂浓度、比例和时间下进一步筛选提取条件与提取次数。采用L9(34)正交水平表进行实验，以提取所得的总砷含量为监控指标，考查辅助提取手段(涡旋震荡，超声，98 ℃水浴)，提取次数(1、2、3次)，提取剂用量(6、8、12 mL)3种因素对提取结果的影响。按2.2节实验方法和表3中设计的实验方案进行提取和测定，提取结果见表3，利用极差分析进行主要影响因素和最佳提取条件的确定，结果见表4和图2。

表3 提取条件与提取次数的正交实验结果

表4 正交实验极差分析

由正交实验极差分析结果可知：RA>RB>RC，即影响提取效果的因素顺序为：提取方式>提取次数>试剂量。极差结果表明，提取方式是影响提取率的主要因素，使用水浴方式获得的提取率远高于超声提取，效率最低的是涡旋震荡。前人虽强调了超声提取的优势[20，21]，然而在本实验中证实加热确实比超声提供更大的能量以满足砷从土壤矿物晶格中释放，这与Huber[22]等人的研究结论相同；增加提取次数，提取率大幅提高，从58.4%提升至82.0%；提取剂用量对提取率影响甚微，增加试剂量，提取率反而略有减小。

综合以上结果表明，改进的最佳提取条件为，使用6 mL 1.5 mol/L的磷酸+盐酸提取剂(比例为4∶1)，用98 ℃水浴提取3次，每次60 min。经试验，在该条件下，提取率可达91.34%。

图2 提取条件和提取时间的效应曲线

3.4 加标回收实验

采用改进的实验条件对土壤标准样品GSS-32中进行加标回收实验，测定结果见表5。

表5 土壤中不同形态砷的加标回收率

实验结果发现As(Ⅲ)回收率仅为25.80%，而As(V)回收率为114.44%，说明在提取过程中由于基质的影响As(III)和As(V)之间发生了转化，As(Ⅲ)全部氧化成了As(V)，这样的结果并不能真实的反映土壤中原有砷的各形态含量。为提高三价砷的回收率，参考前人的研究基础[23,24]，在加入提取剂同时加入一定量的预还原剂(0.1，0.15，0.2 mol/L的抗坏血酸)，再一次做加标回收实验予以分析。

实验结果显示，加入预还原剂后As(Ⅲ)的回收率得以提高。随着预还原剂的用量增大，As(Ⅲ)的回收率增大而As(V)的回收率减小，用量过大，则导致As(V)向As(Ⅲ)转化，因此最佳的抗坏血酸用量是0.15 mol/L。数据表明，该标准物质中As(V)占总砷含量的97.60%(表6)。

3.5 方法的精密度

称取土壤标准物质GSS-33和GSS-35各0.2000 g按照最优实验方法进行形态分析，共进行6组实验，结果见表7。

表6 加入预还原剂后土壤中不同形态砷的加标回收率

表7 方法精密度结果

实验结果表明，使用该法获得的As(Ⅲ)相对标准偏差为1.60～2.18%，As(V)相对标准偏差为0.70～0.85%，精密度良好，浸取方法稳定可靠。从结果还可以看出，GSS-33标准物质中As(V)为总砷的95.9%，GSS-35标准物质中As(V)为总砷的98.0%。

3.6 实际样品分析

以采自广东汕头莲花山钨矿区周围5个不同地点的土壤为样品，采用最优实验方法进行砷形态分析。

表8 实际样品砷形态分析

测量结果表明(表8)，5种不同采样点的土壤中蔬菜地砷含量最高，但所有采样点的砷含量均未超过国家颁布的《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)，且大部分砷以毒性较低的As(V)形态存在。然而，②号蔬菜地和④号水稻土比全国平均土壤含砷量9.2 μg / g[25]高出2.72和1.68倍，对人类健康具有潜在的危害。

4 结论

采用正交实验设计的方法，对以前分析砷形态的条件进行改进优化。改进后，使用1.5 mol/L的磷酸混合盐酸(4∶1)和0.15 mol/L的抗坏血酸对0.2000 g土壤经98 ℃水浴萃取3次，每次1 h，可获得最高的浸取率(91.34%)。在此条件下，经加标回收验证，As(Ⅲ)和As(V)获得较高的回收率且在误差允许范围(n=6，RSD，0.695～2.176%)，精密度良好，该方法是一种提取土壤中砷形态的简单高效方法。