葛根素防治绝经后骨质疏松症的研究进展▲

周昊楠 陈远明

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530001，电子邮箱：zzhhnnyy@163.com； 2 广西医科大学第二附属医院骨科，南宁市 530007)

【提要】 葛根素又称葛根黄素，是从天然植物葛根中分离的单体化合物，具有异黄酮结构，与雌激素结构类似，主要存在于豆科植物葛及野葛的根中。目前临床上主要用于防治冠心病、心绞痛、高血压。近年来，越来越多的体内外实验研究发现，葛根素作为一种植物雌激素，具有抑制破骨细胞分化、促进成骨细胞生成、增加骨量、改善骨代谢的作用。本文对近十年来葛根素防治绝经后骨质疏松症的研究进展进行综述。

骨质疏松症是一种代谢性疾病，涉及全身骨骼。原发性骨质疏松症分为老年性骨质疏松症与绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)，PMOP是女性绝经后的常见病之一。目前学者们认为PMOP主要是卵巢功能衰退，雌激素水平下降，骨吸收大于骨形成，进而导致骨量减少以及骨组织显微结构退行性变，临床表现为骨脆性增加、易骨折、骨骼易变形、骨折不愈合等，对老年人身心健康造成严重影响[1]。其中雌激素缺乏是绝经后女性骨丢失的主要原因。已有临床研究证明雌激素或雌孕激素联合治疗PMOP的疗效显著，该疗法能维持并提高骨密度，降低骨质疏松性骨折的发生风险，是防治PMOP的有效手段[2]。但长期使用雌激素有促子宫内膜增生和增加冠心病、脑卒中、肺栓塞、乳腺癌等发生率的风险。有学者提出采用植物雌激素，如葛根素等替代雌激素治疗PMOP。本文对近十年来葛根素防治PMOP的研究进展进行综述。

1 葛根素的理化性质及药理作用

自20世纪50年代葛根素被分离鉴定以来，其作为一种从野葛根中提取出来的异黄酮类植物提取物，被广泛用于临床研究和动物实验研究，现已被认为是一种重要的植物雌激素。葛根素化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羟基异黄酮，分子式为C21H20O9，相对分子质量为416.38，化学结构式见图1。常温常压下低含量的葛根素为棕色粉末，高含量葛根素为白色针状结晶粉末。目前，我国批准的葛根素剂型主要有注射剂和滴眼液2种，更多新剂型也在不断开发与改进[3]。葛根素的药理作用主要有：保护脏器组织、抗缺血再灌注损伤、改善血液流变学指标、调控骨代谢、抑制钙超载、降眼压、雌激素样作用等，适用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动静脉阻塞、突发性耳聋等疾病的治疗，疗效显著[4]。

图1 葛根素的化学结构式

2 葛根素防治PMOP的细胞实验研究

关于葛根素对成骨细胞的影响，国内外众多学者做了大量的研究。王建华等[5]发现葛根素在体外能促进成大鼠骨细胞的增殖与分化。王久亮等[6]进一步证实了葛根素对骨形成的作用：一是通过提高碱性磷酸酶活性进而促进成骨细胞分化；二是通过雌激素受体介导促进成骨细胞的骨形成效应。刘永庆等[7]发现葛根素和国产多孔钽支架能协同促进成骨细胞Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen，COL-Ⅰ)、骨钙素的表达，从而促进成骨细胞的增殖。也有学者发现表面结合葛根素的钛合金可以促进前成骨细胞成骨分化[8]。王昌等[9-11]发现葛根素对Wistar大鼠的成骨细胞的影响存在剂量依赖性，并且具有双向性，即在低浓度(10-8～10-5mol/L)下促进骨形成，在高浓度(10-4～10-3mol/L)下抑制骨形成；并且其在之后的研究中发现葛根素在体外对过氧化氢介导的Wistar大鼠成骨细胞氧化损伤具有保护作用。Suthon等[12]亦证实了葛根素的抗骨质疏松作用具有时间依赖性、剂量依赖性及双向性。林树忠等[13]的实验结果表明葛根素在40 μmol/L和80 μmol /L浓度时可促进矿化结节形成，证实葛根素对体外培养的大鼠成骨细胞有明显的促进增殖作用。孙玉敏等[14]采集并培养老年女性骨质疏松症患者股骨颈松质骨成骨细胞，发现葛根素能够提高成骨细胞碱性磷酸酶及骨钙素活性，具有明显的促进成骨细胞分化成熟的作用，且0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol /L的葛根素可呈浓度依赖性促进老年女性骨质疏松症患者成骨细胞增殖。Wang等[15]体外细胞实验发现葛根素可以促进成骨生成和抑制脂肪生成。Liang等[16]发现葛根素对于糖尿病性骨质疏松症具有一定的保护作用，这种保护作用可能是通过抑制半胱天冬酶-3的表达产生。卢宇等[17]发现葛根素可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。Wang等[18]发现葛根素能刺激碱性磷酸酶活性，促进COL-Ⅰ分泌以及原代成骨细胞矿化结节形成，而雌激素受体抑制剂则可以减少由葛根素诱导的碱性磷酸酶活性增加和COL-Ⅰ的分泌量；此外，葛根素可呈时间依赖性地提高p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和β-链蛋白的水平，而葛根素提高p38 MAPK和β-链蛋白水平的作用受到雌激素受体抑制剂的抑制，但其提高β-链蛋白水平的作用不受p38 MAPK抑制剂影响。这表明雌激素受体、p38 MAPK和Wnt/β-链蛋白途径都与葛根素诱导成骨细胞分化以及骨形成有关。于冬冬等[19-20]发现葛根素通过半胱天冬酶调节核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路，抑制地塞米松诱导的hFOB 1.19人成骨细胞凋亡；通过p38 MAPK通路，抑制地塞米松诱导的MC3TE-E1小鼠成骨细胞株细胞凋亡。赵艳威等[21]发现葛根素可通过促进人成骨样细胞系MG-63细胞中碱性磷酸酶活性和COL-Ⅰ分泌，促进成骨细胞分化成熟，该作用可被纯雌激素受体阻断剂ICI 182,780完全阻断，微小RNA干扰实验结果进一步证实葛根素对成骨细胞碱性磷酸酶活性、COL-Ⅰ分泌的调节作用是由雌激素受体α和雌激素受体β共同介导的。此外，Wang等[22]还发现葛根素促进人成骨细胞增殖分化的作用是通过激活丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)和磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号实现的，Liu等[23]亦证实葛根素通过ERK信号传导通路抑制人成骨细胞的凋亡,还有学者也证实了葛根素促进大鼠成骨细胞的骨形成可能是通过激活PI3K/Akt途径来调节的[24]。张莹莹等[25-26]发现葛根素可促进小鼠成骨细胞增殖，并通过下调靶向Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)的微小RNA的表达来提高RUNX2表达水平。Sheu等[27]认为葛根素可能通过诱导骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)和一氧化氮合成，进而调节成骨特异性转录因子Cbfa1/RUNX2、成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor κB ligand，RANKL)基因的表达来发挥诱导成骨细胞增殖分化、促进骨形成的作用，而且当葛根素浓度为10-8mol/L时，成骨细胞分化能力达到最强。Shan等[28]发现葛根素通过miR-106b调节RANKL基因促进MC3T3-E1小鼠成骨细胞成骨分化。罗婷等[29]发现葛根素可明显抑制人成骨样细胞系MG-63细胞白细胞介素(interleukin，IL)-6表达和IL-6基因启动子的转录活性，并且该作用可被纯雌激素受体阻断剂ICI 182，780部分阻断，微小RNA干扰实验结果进一步证明葛根素通过雌激素受体α实现对成骨细胞IL-6的抑制作用。Lv等[30]的实验显示，葛根素可能通过一氧化氮/环磷酸鸟苷信号通路诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖和成骨分化。Wang等[31]发现葛根素可以在体内外抑制BMSCs的脂肪分化，防止酒精诱发性骨坏死。蔡花等[32]发现葛根素能促进脐带间质干细胞向成骨分化。也有学者发现葛根素通过ERK1/2和p38-MAPK途径促进BMSCs增殖分化[33]。

除了促进成骨分化，葛根素还能作用于破骨细胞，抑制骨吸收。詹秀琴等[34]发现葛根素可刺激成骨细胞信号转导蛋白Smad2/3 mRNA的表达和刺激转化生长因子β1的分泌和合成，从而促进骨形成，抑制骨吸收。Tiyasatkulkovit等[35]通过研究葛根素对骨肉瘤细胞UMR106的作用，发现葛根素可以使骨肉瘤细胞碱性磷酸酶mRNA表达上调，促进成骨细胞分化，从而增加骨形成；之后采用狒狒成骨细胞进行实验[36]，发现葛根素可促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶以及COL-Ⅰ的表达，并且减少破骨细胞介导的骨吸收。也有学者[37]发现葛根素可以抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化，通过抑制破骨细胞活化因子肿瘤坏死因子-α、IL-1β、小鼠前列腺素E2，抑制破骨细胞原基因(包括抗磷酸酯酶、组织蛋白酶K以及基质金属蛋白酶9)的表达，并且葛根素能抑制破骨前体细胞RAW264.7被脂多糖激活而产生Akt。刘浩等[38]发现不同质量、浓度葛根素在体外对1，25-(OH)2D3促破骨细胞骨吸收功能均有抑制作用，其最佳抑制剂量在10～50 μg/L。袁斯远等[39]采用小鼠成骨细胞进行实验，发现葛根素和雌二醇能够延长细胞碱性磷酸酶表达时间，在第12天达到高峰；在第10天和第12天能够增加细胞骨涎蛋白mRNA的表达；在第5天和第12天能够减少细胞骨桥蛋白的表达；在第10天和第12天能够增强细胞骨钙素表达。这说明葛根素能够通过影响成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA的表达，促进成骨细胞的分化，这可能是葛根素抗骨质疏松的重要细胞分子机制之一；其之后的实验显示，与空白对照组相比，葛根素组小鼠成骨细胞RANKL mRNA表达降低，OPG/RANKL mRNA表达升高[40]。因此得出结论：葛根素能够直接抑制破骨细胞形成和上调成骨细胞OPG/RANKL mRNA表达而间接调控破骨细胞，这可能是葛根素抗骨吸收作用的重要细胞分子机制；且葛根素不会造成子宫重量增加[41]。

3 葛根素防治PMOP的动物实验研究

Tanaka等[42]发现葛根藤的乙醇提取物(Pueraria lobata vine ethanol extracts，PVEE)由约80%的纤维，10%的葛根素，3.6%的黄豆苷，2.5%的丙二酰大豆黄甙，以及其他的小异黄酮组成；与喂食普通食物的卵巢摘除小鼠相比，喂食含PVEE食物的卵巢摘除小鼠的骨吸收标记物显著减少，股骨远端成熟破骨细胞数量也相应减少，且股骨矿物质密度的减少受到抑制。PVEE还显示出弱雌激素作用[42]，但抑制骨质疏松效应主要由葛根素产生，抑或是多种成分交互作用，仍需要进一步验证。

IL-6 是一种骨吸收刺激因子，主要作用于破骨细胞前体细胞，促使其向破骨细胞分化，发挥骨的重吸收作用。IL-6能刺激成骨细胞中RANKL的表达，通过RANKL与核因子κB受体活化因子相互作用，促进破骨细胞分化，从而促进骨吸收[3]。罗显禄[43]给予卵巢摘除Wistar大鼠不同剂量的葛根异黄酮灌胃，结果显示葛根异黄酮能明显增加股骨中点及远心端骨密度，升高血清胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)水平，降低血清IL-6水平，并且能较好地增加成骨细胞BMP-2表达水平。这表明葛根异黄酮能够改善骨质疏松，可能与下调IL-6表达水平和提高成骨细胞BMP-2的表达有关。Wang等[44]亦证实葛根素能抑制RANKL和IL-6产生。Park等[45]发现葛根素通过下调环磷腺苷效应元件结合蛋白、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1β、原癌基因蛋白c-Fos和活化T细胞核因子胞浆1型等信号因子，抑制RANKL调节的破骨细胞生成。周强等[46]研究结果显示，葛根素可以通过调节IGF-1的表达，从而加快卵巢摘除大鼠骨质疏松性骨折的愈合。有研究证实葛根素属的异黄酮类植物雌激素能够增加卵巢摘除大鼠的骨密度，可有效防治卵巢摘除大鼠的骨量丢失，具有类雌激素样作用，但增加子宫重量的作用不明显，因此用于治疗PMOP有较好的安全性[47]。研究证实葛根素对卵巢摘除大鼠的骨质疏松症有良好治疗效果，但对铅中毒所致的骨质疏松症无效，且小剂量的雌二醇联合葛根素对卵巢摘除大鼠的治疗效果，与单独使用较大剂量的葛根素或较大剂量的雌二醇的治疗效果相近，且25 mg/kg、1次/d葛根素+100 μg/kg、2次/周雌二醇是治疗卵巢摘除大鼠骨质疏松的最佳搭配剂量[48-55]；而小剂量雌二醇与葛根素联合或较大剂量葛根素对卵巢摘除大鼠子宫内膜、肌层和腺体、阴道上皮和肌层的促增生作用较弱，且葛根素治疗卵巢摘除大鼠骨质疏松症对其肾功能也无明显影响，但较大剂量雌二醇可明显促进卵巢摘除大鼠阴道上皮和肌层增生[56-58]。王新祥等[59]的实验也证实葛根虽然不具有雌二醇显著刺激子宫重量增加的作用，但具有与雌二醇相当的抗骨质疏松作用。刘浩等[60]发现葛根素可以通过刺激成骨细胞的增殖和分化增强骨的形成，同时对脂肪的分化有轻微的抑制作用；对卵巢摘除大鼠采用葛根素联合锌治疗能在一定程度上逆转骨质疏松，且未见明显增加子宫重量和IGF-1蛋白质表达，子宫内膜腺上皮也未见明显增生[61-62]。张明宇等[63]发现葛根素不仅能在体外促进成骨细胞增殖和分化，且将成骨细胞植入大鼠背部肌肉后，肌肉注射葛根素组的成骨率高于未注射葛根素的对照组。黄彤等[64-65]用含不同剂量葛根素的饲料喂养大鼠，结果发现喂养葛根素的各组小鼠其胫骨骨矿含量、骨钙含量、股骨密度和肱骨所能承受的最大压力明显高于喂养不含葛根素饲料的模型组，说明服用葛根素后大鼠骨量、骨强度增加，血清骨吸收亢进引起的相关骨代谢指标水平得到改善。Cho等[66]用含葛根素饲料喂养卵巢摘除大鼠，结果发现大鼠血浆中17β-雌二醇含量明显增高，而甘油三酯水平、腹部脂肪组织重量明显下降，肝内酶含量无明显变化，骨密度的减少受到显著抑制；同时，实时定量PCR检测分析结果显示芳香酶基因表达受到抑制，而雌激素硫酸转移酶SULT1E1基因表达增强，表明葛根素具有雌激素样作用，且不会增加大鼠患乳腺癌的风险。Chen等[67]发现采用葛根素治疗可以改善宫内生长受限大鼠的骨质流失情况。郑红星等[68]发现葛根异黄酮与维生素D3联合给药，对卵巢摘除骨质疏松大鼠骨组织的修复作用优于葛根异黄酮单独给药。

4 葛根素防治PMOP的临床研究

目前关于葛根素防治PMOP的临床研究开展较少。李俊华等[69]采用葛根素治疗PMOP患者，结果显示用药30 d后血清IL-4、IL-6下降、IL-10含量上升，且体内雌激素含量无显著变化，说明葛根素可以在一定程度上替代雌激素作为PMOP的治疗药物。Manonai等[70]给予健康的绝经后妇女20 mg、30 mg、50 mg葛根素胶囊(葛根素组)或同等剂量安慰剂(对照组)治疗24周，结果显示与对照组相比，葛根素组血中碱性磷酸酶含量显著下降，而葛根素治疗组和安慰剂组都没有出现子宫内膜增生，乳腺组织、全血细胞计数、肝肾功能没有显著变化，因此可以认为葛根素在骨代谢方面具有类雌激素样作用，但未表现雌激素副作用。

5 总结与展望

中药是传统医学的巨大宝库，葛根素用于防治PMOP值得我们深入研究。目前关于葛根素抗骨质疏松的实验研究主要集中于细胞实验和动物实验。各实验都证实葛根素能促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞，促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进骨形成，提高骨密度。多数学者认为葛根素具有类雌激素样作用，但日本学者Michihara等[71]认为葛根素的抗骨质疏松作用并不是通过雌激素受体途径实现的，因此关于葛根素防治骨质疏松的分子机制仍需要更强有力的证据。此外，脂肪组织与骨髓在胚胎发育过程中均源自中胚层，脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞均来自中胚层的成体干细胞，脂肪干细胞可以诱导脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等，分化成何种细胞与诱导因子和外部环境有关[72]。那么葛根素能否诱导脂肪干细胞成骨分化呢？目前关于葛根素诱导脂肪干细胞，特别是人脂肪干细胞成骨分化的研究不多，有待我们更进一步深入地探索。