不同施氮水平对羊草抗衰老能力的影响

朱爱民，张玉霞，王显国，王月林，张庆昕，侯文慧，杜晓艳

(1.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028041； 2.中国农业大学 动物科技学院，北京 100083；3.内蒙古农业大学 草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018； 4.内蒙古自治区草原站，内蒙古 呼和浩特 010017)

羊草(Leymuschiueusis)，又称碱草，是多年生根茎型植物，隶属禾本科赖草属[1]，是欧亚大陆草原带东端植被建群物种[2-3]。内蒙古草原不仅是欧亚大陆草原的主要组成部分，其物种组成和群落结构也是我国温带草原的典型代表[4]，羊草在东北草原和内蒙古草原经常形成大面积的单优种植被[5-7]。在长期环境选择压力下，羊草对不同生境表现出较强的适应能力，具有抗寒冷、抗干旱、耐盐碱等特性[8]。此外，羊草具有产量高、蛋白质含量高、适口性好、再生力强、持绿期长、叶量多等特性，是一种优质高产的牧草资源，目前在发展人工草地、改良退化草原、发展草原畜牧业等方面占有重要地位[9-12]。

植物衰老是指植物的一个器官或植株整个生命功能衰退的一系列变化过程，并最终导致植物自然死亡[13]。Mccord等[14]研究表明，植物衰老是由于植物体内活性氧代谢紊乱引起。研究表明植物衰老的过程，包括光合作用能力减弱并丧失、叶绿体解体、二氧化碳固定、酶的降解等变化过程。近年来，国内学者关于植物衰老与活性氧自由基关系的研究不断深入[15]，主要集中在小麦[16]、水稻[17]、玉米[18]和棉花等[19]作物上，得出叶片进入衰老时期表现为光合能力下降，维持叶片功能的叶绿素含量下降，活性氧代谢紊乱失衡等。引起植物衰老的因素有很多，有内在因素，也有外在因素。不合理施用氮肥也会造成羊草生长受阻，从而引起羊草植株衰老，影响羊草产量和品质。

科尔沁地区降水量少、土壤沙化瘠薄等不利条件和管理水平共同制约羊草人工草地的栽培和产量发挥，沙地羊草施肥模式及适宜施肥量前人研究较少。对人工建植的沙地羊草草地施不同水平N肥，探究不同N水平下对1茬、2茬沙地羊草叶片衰老特性的影响，确定科尔沁沙地羊草适宜N施用量，以便为该地区羊草草地的建植提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验区自然概况

试验地设在内蒙古自治区通辽市育新村农田，地理位置E 116°21′～120°58′，N 41°17′～45°24′，温带半干旱大陆性气候。年平均气温0～6℃，≥10℃积温3 000～3 200℃，无霜期140～150 d，年平均降水量350～400 mm，蒸发量是降水量的5倍，年平均风速3～4.4 m/s。土壤以沙土为主，pH 8.0，土壤有机质含量0.65%，碱解氮36.37 mg/kg，速效磷含量3.81 mg/kg，速效钾含量78.51 mg/kg，全氮含量0.037%。

1.2 供试材料与方法

供试材料为2016年人工建植长势一致的羊草草地(羊草品种为吉农1号)。

试验区采取随机区组设计，设置了0(CK)、100、200、300、400 kg/hm2的施氮(N)量，分别用N0、N1、N2、N3、N4表示，氮肥为尿素(氮含量为46%)，同时每个处理均施磷肥(P2O5)200 kg/hm2，钾肥(K2O)200 kg/hm2，分别用重过磷酸钙(P2O5含量为44%)和氯化钾(K2O含量为60%)替代。小区面积为12 m2，3次重复，共15个小区。于2017年4月20日(返青期)、5月20日(拔节期)、7月5日(分蘖期)、8月25日(拔节期)进行人工追施氮肥，每次追施氮肥用量均为全年用氮量的25%；4月20日和7月5日分别追施全年磷肥和钾肥施用量的50%，施肥采用撒施方式，施肥后立即进行灌水。于6月20日(初花期)进行第1茬刈割，9月25日(初花期)进行第2次刈割，分别进行上部叶片(旗叶和倒二叶)和下部叶片(倒三叶和倒四叶)抗衰老指标的测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 光合特性指标 叶片叶绿素含量测定，先将叶片剪碎混匀，用80%丙酮浸提法[20-21]测定，重复3次。

1.3.2 抗氧化特性指标 采用丙二醛测定硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑法；过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法；过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法测定，全部参照文献[20]的方法。

1.4 数据分析

试验数据用Microsoft Excel 软件处理、做图和制作表格，SPSS 17.0软件进行方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同N肥水平对沙地羊草叶片抗衰老特性的影响

2.1.1 不同N肥水平对第1茬沙地羊草叶片中SOD活性的影响 第1茬沙地羊草上部叶片中SOD活性均高于下部叶。随施N水平的增加，羊草上部叶片SOD活性呈先增加后降低的趋势。N0处理下的SOD活性最小，为179.43 U/g，显著低于其他N处理。N3水平上部叶片SOD活性最高，为318.00 U/g，显著高于其他N处理。

N2处理下的下部叶片SOD活性最强，为162.81 U/g，显著大于其他N处理。N1，N3和N4水平下沙地羊草上部叶片中SOD活性差异未达到显著水平，分别是162.81，176.65 和176.10 U/g，均显著大于N0水平(图1)。

图1 不同N肥水平处理下第1茬沙地羊草叶片的SOD活性Fig.1 Effect of different N fertilizer levels on SOD activity in leaves ofLeymus chinensisin one stubble注：不同小写字母表示不同施肥水平差异显著(P<0.05)，下同

2.1.2 不同N肥水平对第2茬沙地羊草叶片SOD活性的影响 第2茬沙地羊草上部叶片中SOD活性均高于下部叶。不同施N水平间上部叶片中SOD活性无显著差异(P>0.05)，其中，未施N条件下，上部叶片中SOD活性最高，为295.24 U/g，SOD活性最弱的是N3水平，为281.69 U/g(图2)。

下部叶片SOD活性最强的是N1水平，达到288.04 U/g，显著高于N3和N4水平(P<0.05)。N3和N4水平下沙地下部叶片SOD活性较弱，分别是254.17和246.75 U/g(图2)。

2.1.3 不同N肥水平对第1茬沙地羊草叶片中POD活性的影响 第1茬沙地羊草上部叶片中POD活性高于下部叶。N0水平上部叶片POD活性最弱，为1 283.04 U/(min·g)，显著低于其他施N水平。N1、N2、N3和N4水平下上部叶片中POD活性差异未达到显著水平，分别是1 722.31、1 739.69、1 738.00和1 740.87 U/(min·g)(图3)。

图2 不同N肥水平处理下第2茬沙地羊草叶片的SOD活性Fig.2 Effect of different N fertilizer levels on SOD activity in leaves ofLeymus chinensisin two stubble

N0水平下部叶片中POD活性最弱，为356.48 U/(min·g)，显著低于其他施N水平(P<0.05)，N3水平下沙地下部叶片中POD活性最高，为1 255.64 U/(min·g)，显著高于其他施N水平(图3)。

图3 不同N肥水平处理下第1茬沙地羊草叶片的POD活性Fig.3 Effect of different N fertilizer levels on POD activity in leaves ofLeymus chinensisin one stubble

2.1.4 不同N肥水平对第2茬沙地羊草叶片中POD活性的影响 第2茬沙地羊草上部叶片中POD活性低于下部叶。随施N水平的增加，羊草上部叶片和下部叶片中POD活性均呈先增加后降低的趋势。上部叶片POD活性最弱的是N0水平，为1 731.25 U/(min·g)，显著低于其他N水平。N2，N3和N4水平上部叶片POD活性无显著性差异(P>0.05)，分别为2 334.66，2 280.56和2 274.20 U/(min·g)(图4)。

N2水平的下部叶片中POD活性最强，为3 378.41 U/(min·g)，显著大于其他N处理。N0水平的下部叶片中POD活性最低。N3和N4水平处理的下部叶片POD活性分别是2 959.66和2 839.77 U/(min·g)，差异不显著(图4)。

图4 不同N肥水平处理下第2茬沙地羊草叶片的POD活性Fig.4 Effect of different N fertilizer levels on POD activity in leaves ofLeymus chinensisin two stubble

2.1.5 不同N肥水平对第1茬沙地羊草叶片中CAT活性的影响 第1茬沙地羊草上部叶片中CAT活性低于下部叶。随施N水平的增加，上部叶片CAT活性逐渐增加。N0水平下上部叶片中CAT活性最低，为37.46 U/(min·g)，显著低于其他施N处理。N1、N2、N3和N4水平下上部叶片中CAT活性差异未达到显著水平，分别为55.61、60.93、63.13和64.17 U/(min·g)(图5)。

N3水平下羊草下部叶片CAT活性最强，为105.65 U/(min·g)，显著高于其他N水平。N1，N2和N3处理间下部叶片中POD活性差异不显著(P>0.05)。N0水平下羊草下部叶片CAT活性最弱，为47.83 U/(min·g)，显著低于其他施N水平(图5)。

2.1.6 不同N肥水平对2茬沙地羊草叶片中CAT活性的影响 N0和N4水平下2茬沙地羊草上部叶片中POD活性低于下部叶，但N1，N2和N3水平下上部叶片中CAT活性明显高于下部叶。随施N水平的增加，上部叶片中CAT活性呈先增加后降低的变化。上部叶片中CAT活性最高的是N3水平，显著大于其他N水平。N4水平下上部叶片中CAT活性最弱，为24.25 U/(min·g)，显著低于其他N水平下上部叶片中的CAT活性。N0，N1和N3水平下上部叶片中CAT活性差异不显著(图5)。

羊草下部叶片中CAT活性最高的是N0水平，达到39.00 U/(min·g)，显著高于其他N水平。其他N水平下部叶片中的CAT活性差异不显著(图6)。

图5 不同N肥水平处理下第1茬沙地羊草叶片的CAT活性Fig.5 Effect of different N fertilizer levels on CAT activity in leaves ofLeymus chinensisin one stubble

图6 不同N肥水平处理下第2茬沙地羊草叶片的CAT活性Fig.6 Effect of different N fertilizer levels on CAT activity in leaves ofLeymus chinensisin two stubble

2.1.7 不同N肥水平对第1茬沙地羊草叶片中MDA含量的影响 除N1水平外其他N水平下第1茬沙地羊草上部叶片中的MDA含量均低于下部叶。N1，N2和N3水平的上部叶片中MDA含量较高，分别为29.52，27.03和27.33 nmol/g，均显著高于N0和N4水平(图7)。

随施N水平的增加，下部叶片中MDA含量呈先降低后增加的趋势。N1水平下沙地羊草下部叶片中的MDA含量最低，为24.23 nmol/g，显著低于其他N水平。N3和N4水平的下部叶片中MDA含量显著高于其他水平，分别为32.67和34.57 nmol/g(图7)。

2.1.8 不同N肥水平对2茬沙地羊草叶片中MDA含量的影响 N1和N2水平下2茬沙地羊草上部叶片中MDA含量低于下部叶，其他N水平的上部叶片中MDA含量高于下部叶。随施N水平的增加，上部叶片中MDA含量逐渐降低。上部叶片中MDA含量最高的是N0水平，为39.46 nmol/g，显著大于N3和N4水平，但较N1和N2水平差异不显著(图8)。

图7 不同N肥水平处理下第1茬沙地羊草叶片的MDA含量Fig.7 Effect of different N fertilizer levels on MDA content in leaves ofLeymus chinensisinin one stubble

图8 不同N肥水平处理下第2茬沙地羊草叶片的MDA含量Fig.8 Effect of different N fertilizer levels on MDA content in leaves ofLeymus chinensisin two stubble

随施N水平的增加，羊草下部叶片中MDA含量呈先增加后降低的变化。N1水平的下部叶片中MDA含量最高，为39.78 nmol/g，显著大于其他N水平。N0，N3和N4水平的下部叶片中的MDA含量较低，分别是31.33，30.41和30.00 nmol/g，均显著低于N1和N2水平(图8)。

2.2 不同N肥水平对沙地羊草叶片中叶绿素含量的影响

2.2.1 不同N肥水平对第1茬沙地羊草上部叶片中叶绿素含量的影响 随施N水平的增加，第1茬沙地羊草上部叶片中叶绿素a、b含量均呈先增加后降低的变化，且均是在N1水平下达到最大。上部叶片中叶绿素a、b含量最低的均是N0水平，分别为1.07 mg/g和0.75 mg/g，均显著低于N1，N2和N3水平。

上部叶片中叶绿素含量较高的是N1和N2水平，分别为3.18和2.83 mg/g，显著高于N0，N3和N4水平。上部叶片中类胡萝卜素含量最高的是N4水平，达到0.24 mg/g，显著高于N0水平。说明适当施N可有效增加沙地羊草叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量，提高光合效率(表1)。

表1 不同N肥水平下第1茬沙地羊草上部叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2.2 不同N肥水平对第1茬沙地羊草下部叶片中叶绿素含量的影响 随施N水平的增加，第1茬沙地羊草下部叶片中叶绿素a、b含量均呈先增加后降低的变化，其中N1水平下沙地羊草下部叶片中叶绿素a含量最高，达到1.52 mg/g，显著高于N0水平，N3水平下沙地羊草下部叶片中叶绿素b含量最高，为1.55 mg/g，显著大于N0，N2和N4水平。

下部叶片中叶绿素含量最高的是N3水平，为2.88 mg/g，显著大于N0水平，但较其他施N水平未达到差异显著水平。N4水平的下部叶片中类胡萝卜素含量最高，达到0.28 mg/g。N0水平的下部叶片中类胡萝卜素含量最低，为0.18 mg/g(表2)。

表2 不同N肥水平下第1茬沙地羊草下部叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量

2.2.3 不同N肥水平对第2茬沙地羊草上部叶片中叶绿素含量的影响 第2茬沙地羊草上部叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均随施N水平的增加而增加。其中N1水平的上部叶片中叶绿素a含量最高，为1.35 mg/g，显著高于N0，N3和N4水平。N3水平的上部叶片中叶绿素b含量最高，达到1.23 mg/g，显著大于其他N水平。

上部叶片中叶绿素含量较高的是N1，N2和N3水平，分别为2.10，1.99和1.81 mg/g，显著高于N0和N4水平。N3水平的上部叶片中类胡萝卜素含量最高，为0.26 mg/g，显著高于N0和N4水平。N4水平的上部叶片中类胡萝卜素含量最低，为0.13 mg/g(表3)。

2.2.4 不同N肥水平对第2茬沙地羊草下部叶片中叶绿素含量的影响 第2茬沙地羊草下部叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量最高的均是N2水平，分别为1.16，0.86和0.25 mg/g。叶绿素a和b含量最少的均是N0水平(表4)。

羊草下部叶片中叶绿素含量最高的也是N2水平，其次是N3水平，均显著高于其他N水平。N0水平的下部叶片中类胡萝卜素含量最低，为0.18 mg/g，显著低于其他N水平。N1，N3和N4水平的下部叶片中的类胡萝卜素含量差异未达到显著水平(表4)。

表3 不同N肥水平下第2茬沙地羊草上部叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量

表4 不同N肥水平下第2茬沙地羊草下部叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量

3 讨论

氮素是同化作用器官的重要组成部分，植株中氮素积累与运转能力的强弱制约着叶片的光合性能，当植株缺氮时叶片中叶绿素的合成受阻[15]，从而导致叶部分功能降低，SOD，POD和CAT活性强弱对植物正常生长至关重要。氮素作为麦类植物生长发育最重要的影响因素之一，袁昌洪等[22]研究表明，随着施氮量的增加，乌牛早叶片中SOD活性呈先升高后降低的趋势，试验与其研究结果一致，施N可显著增加第1茬沙地羊草叶片中SOD，POD和CAT活性，随施N水平的增加，第1茬沙地羊草上部叶片中SOD活性呈先增加后降低的趋势。施大伟等[23]研究报道，抗氧化酶系统中，POD比SOD对叶的衰老影响较大，研究也证明了此观点，随施N水平的增加，第2茬沙地羊草上部叶片和下部叶片中POD活性均亦呈先增加后降低的趋势。与SOD、POD活性变化不同，第1茬沙地羊草叶片中CAT活性随施N量的增加呈先增加后降低的趋势变化，而第2茬沙地羊草叶片中CAT活性变化呈逐渐降低的变化趋势。MDA能抑制细胞保护酶的活性和降低抗氧化物的含量，是膜质过氧化的最终分解产物[24]。与袁昌洪等[22]研究结果不同，其研究发现随着施氮量的增加，乌牛早叶片中MDA含量先增加后降低。推断可能是由于研究植物种类不同出现不同结果，研究表明随施N水平的增加，第1茬沙地羊草下部叶片中MDA含量呈先降低后增加的趋势，N1水平下沙地羊草下部叶片中的MDA含量最低，说明N1水平抗衰老能力较强，有利于羊草生长。这与李京涛等[25]研究结果一致，其研究表明有机肥和一定量的氮肥配合施用能显著抑制植株细胞膜脂过氧化过程，从而延缓植株衰老进程。

氮素是同化作用器官的重要组成部分，植株中氮素积累与运转能力的强弱制约着叶片的光合性能，当植株缺氮时叶片中叶绿素、可溶性蛋白质等[22]的合成受阻，从而导致叶部分功能降低[22]。李淑文等[26]研究表明小麦在缺氮条件下植株叶面积指数减小；路文静等[27]研究表明旱茬小麦在低氮条件下，氮低效小麦叶片中叶绿素含量减少；试验研究表明，随施氮量的增加第1茬和第2茬沙地羊草上部叶片和下部叶片中叶绿素a、b含量均呈先增加后降低的趋势，且第1，第2茬沙地羊草上部叶片中叶绿素含量在N1水平下均最高，叶绿素含量高则有利于植物的光合作用，说明在N1水平下沙地羊草光合效率最高，有利于植物地上物质量的积累。

4 结论

追施氮肥可提高羊草叶片中叶绿素含量，同时可增强叶片中POD和SOD活性，达到推迟羊草衰老的目的；综合不同N水平下活性酶强弱及叶绿素含量变化，科尔沁沙地羊草人工草地建植最佳施氮量为N1(100 kg/hm2)。