一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

李敏华，王 倩，田志军*，金 涛*

(1.黑龙江大学 生命科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的影响世界养猪业健康发展的重要传染病之一。该病毒是单股正链RNA 病毒，属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属[1]。PRRSV 基因组全长约为 15 kb，包含 10 个开放阅读框(ORFs)。ORF1a 和 ORF1b 编码至少 14 个非结构蛋白，包括NSP1α、NSP1β、NSP2-NSP6、NSP7α、NSP7β 和NSP8-NSP12。而 ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7 则编码8种结构蛋白：GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N 和 GP5a[2-3]。PRRSV N 蛋白是构成 病 毒粒 子的主要结构蛋白之一，也是组成病毒核衣壳的唯一蛋白，其主要作用是包裹病毒基因组RNA，但其仅含有 123aa (美洲型)或者 128aa (欧洲型)[4]。研究表明PRRSV N 蛋白虽无中和抗原的作用，却具有极强的免疫原性[5]，猪群在感染PRRSV 后仅需1 周即能够检测到针对 N 蛋白的抗体[6]。同时，N 蛋白具有高度的保守性，使得检测PRRSV N 蛋白抗体成为检测PRRSV 感染的重要指标。目前PRRSV 在我国处于活跃期，对养猪业造成的损失重大。抗体检测方法在疫病防控中起重要作用，而我国目前PRRSV 抗体检测主要依靠国外进口的检测试剂盒，价格昂贵，因此建立特异性好、敏感性高的国产PRRSV 抗体检测方法对我国PRRSV 防控意义重大。

1 材料与方法

1.1 病毒及主要试剂 PRRSV SD53 株(类NADC30 PRRSV)、HP-PRRSV HuN4及其疫苗株 HuN4-F112、其它PRRSV疫苗株(CH-1R、MLV、DV 和 VP046 BIS)、HP-PRRSV M 蛋白MAb及PRRSV阴、阳性血清、质粒 p3XFLAG-CMV、p3XFLAG-CMV-N、pGEX-6P-1、pGEX-6P-1-N、受体菌TG1、Rosetta(DE3)由本实验室保存；PRRSV 各结构蛋白质粒p3XFLAG-CMV-GP2、p3XFLAG-CMV-GP3、p3XFLAGCMV-GP4、p3XFLAG-CMV-GP5、p3XFLAG-CMV-M和p3XFLAG-CMV-N 均由本实验室保存。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、融合剂 PEG、FITC 标记山羊抗小鼠IgG (FITC-IgG)均购自 Sigma公司；GST MAb购自TIANGEN 公 司 ；DyLightTM800 标记的羊抗鼠 IgG 购自 KPL 公司；蛋白 Marker购自Fermentas 公司；IgG 抗体亚类鉴定试剂盒购自Pierce 公司。

1.2 PRRSV MAb 的制备 将PRRSV SD53 株接种到 Marc-145 细胞中，待细胞病变到 80 %～90 %时置-80 ℃反复冻融3 次，收上清，离心后参照文献[7]进行免疫原制备、小鼠免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选纯化以及腹水制备。制备的MAb 按照MAb 亚类鉴定试剂盒说明书进行鉴定。

1.3 MAb 的间接免疫荧光(IFA)检测

1.3.1 阳性杂交瘤细胞筛选与MAb 效价的测定将 PRRSV SD53 株以 6 000 TCID50的剂量感染的Marc-145 细胞作为检测抗原，HP-PRRSV M 蛋白MAb 为阳性对照，SP2/0 细胞培养上清为阴性对照，以待检的杂交瘤细胞上清为一抗，山羊抗小鼠IgG-FITC (1:200)为二抗，采用 IFA 筛选与 PRRSV反应的阳性杂交瘤细胞，并将阳性细胞克隆纯化后制备腹水，10 倍倍比稀释后按照该IFA 方法测定阳性杂交瘤细胞培养液上清和腹水的IFA 效价。

1.3.2 MAb 与 PRRSV 结构蛋白反应的检测 将PRRSV 各结构蛋白质粒 p3XFLAG-CMV-GP2、p3XF LAG-CMV-GP3、p3XFLAG-CMV-GP4、p3XFLAG-C MV-GP5、p3XFLAG-CMV-M 和 p3XFLAG-CMV-N 分别转染293T 细胞，将收获的表达PRRSV 各结构蛋白的细胞作为检测抗原，参照1.3.1 方法，鉴定筛选的MAb 与其反应的结构蛋白。

1.3.3 MAb 特异性的检测 以 HP-PRRSV HuN4 及其疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV、DV 和 VP046 BIS 株感染的Marc-145 细胞为检测抗原，参照1.3.1 IFA 方法，检测 MAb 与其它类型 PRRSV 的交叉反应性。

1.4 MAb 的western blot 鉴定 将感染和未感染PRRSV SD53 株的 Marc-145 细胞作为抗原，参照文献[8]，以制备的 MAb 作为一抗，DyLight 800 标记的山羊抗鼠 IgG (1∶5 000)为二抗，western blot 分析MAb 的反应性。

1.5 MAb 的阻断 ELISA 分析 将超速离心的PRRSV HuN4-F112 株用包被液稀释后置于 96 孔板中，每孔 500 ng，参照文献[9]检测筛选出的 MAb与包被的PRRSV 的结合能否被PRRSV 阳性血清阻断。

1.6 MAb 抗原表位的鉴定 根据PRRSV SD53 株N 蛋白的基因序列设计合成两对引物，以pGEX-6P-1-N 质粒为模板对 N 蛋白基因序列分段PCR 扩增，PCR 产物 N1、N2 部分重叠，将其分别克隆于pGEX-6p-1 载体中，将构建的两个重组质粒转染 293T 细胞后，分别以 GST MAb (1∶5 000)和获得的MAb (杂交瘤细胞培养上清)作为一抗，Dy-Light 800 标记的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)为二抗对获得的 MAb 进行 western blot 鉴定，以确定 MAb 识别的抗原区域。根据鉴定结果，再将N2 片段的基因序列从 5' 端逐步截短分成 N21、N22、N23、N24、N25、N26、N27、N28、N29 和 N30，以上述 western blot 方法进一步鉴定MAb 识别的抗原表位。

1.7 抗原表位序列的比对 从GenBank 中下载28株具有代表性的PRRSV 病毒株，根据MAb 识别的抗原表位，采用DNAStar 对该区域的碱基序列进行保守性分析。

2 结 果

2.1 PRRS V MAb 制备及IFA 检测结果 将小鼠脾细胞与SP2/0 细胞融合后经过4 次亚克隆纯化，通过IFA 方法筛选出1 株稳定分泌 MAb 的杂交瘤细胞株，命名为1H4。经IgG 抗体亚类鉴定试剂盒检测，该 MAb 为 IgG1 亚类，轻链为 κ 链。将杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水分别系列稀释后进行IFA 检测，结果显示细胞MAb 上清和腹水效价分别为 1∶40 和 1∶3 200，与转染 PRRSV各结构蛋白的293T细胞IFA检测结果显示，1H4 MAb 仅 与PRRSV N 蛋白反应(图1，1H4 与其余 PRRSV 结构蛋白反应结果未给出)。MAb 特异性检测结果显示，1H4 与 HP-PRRSV HuN4 及其疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV 均反应，与欧洲型 DV 和 VP046 BIS不反应(图1)。表明本研究制备了一株 PRRSV N 蛋白 MAb，该 MAb 仅与美洲型 PRRSV 株反应，而不与欧洲型PRRSV 株反应。

2.2 MAb 的western blot 鉴定结果 将接种PRRSV SD53 株的 Marc-145 细胞裂解，以 western blot 鉴定MAb 的反应性。结果显示在 10 ku～15 ku 处有 1 条特异性的目的条带，与预期相符合(图2)。表明MAb 1H4 能够特异性识别PRRSV 全病毒。

2.3 MAb 的阻断ELISA 分析结果 以超速离心的PRRSV HuN4-F112 株为包被抗原，利用阻断ELISA分析制备的MAb 的阻断性。结果显示，PRRSV 阴、阳性血清的OD450nm值并未随着其稀释度的增加而有明显变化，且阴、阳性血清OD450nm值之比均高于6(图3)，表明在所测试的稀释度(1∶16)范围内，PRRSV HuN4-F112 株阳性血清能够很好地阻断MAb与病毒的结合，即 1H4 与病毒的结合能被PRRSV阳性血清阻断。

图1 以感染PRRSV 不同病毒株或转染表达PRRSV N 蛋白重组质粒的293T 细胞对1H4 MAb 的 IFA 鉴定Fig.1 Identification of the MAb on 293T cells infected with different PRRSV strains or transfected with the recombinant plasmid expressing PRRSV N protein by IFA

图2 1H4 MAb 与 PRRSV 反应的western blot 检测结果Fig.2 Identification of 1H4 MAb by western blot

2.4 MAb 针对的抗原表位的鉴定 将PRRSV SD53株 N 蛋白序列分成 N1 和 N2 两段，原核表达后，western blot 结果显示1H4 MAb 仅与片段 N2 发生特异性结合；再将N2 片段的序列从5' 端逐步截短分成 N21、N22、N23、N24、N25、N26 和 N27。再继续截短成 N28、N29 和 N30，结果显示，1H4 MAb能够与前7 个片段发生反应，而均不与后面3 个片段反应(图4)，表明1H4 MAb 识别的氨基酸序列是PRRSV SD53 株N 蛋白长度为17 个氨基酸的片段，即 aa107～aa123：107PTQHTVRLIRATASPSA123。

图3 PRRSV HuN4-F112 株阳性血清阻断1H4 MAb 与病毒结合的结果Fig.3 The detection of the binding activity of the MAb to the virus blocked by PRRSV-positive serum

图4 1H4 MAb 对PRRSV-N B 细胞抗原决定族的多肽扫描技术鉴定Fig.4 Identification of PRRSV-N B-cell epitope with the MAb by pepscan technique

2.5 MAb 表位序列的比对分析 利用DNAStar 软件对近年分离的28 株国内外PRRSV 株相应区域的氨基酸序列进行比对分析，结果显示其N 蛋白末端aa107～aa123 在 HP-PRRSV中高度保守；在经典PRRSV 中有 2 个突变位点，相对保守；在类NADC30 PRRSV 中的突变情况与经典株比较接近，但变异程度比经典株大(图5)。然而，1H4 与经典株CH-1R、MLV 和类 NADC30 PRRSV 进行 IFA 检测均有荧光反应，表明在N 蛋白Q109H 和A117V 两个氨基酸位点的突变不影响1H4 对该表位的识别，表明1H4 识别的抗原表位在美洲型PRRSV 株中高度保守。

图5 MAb 1H4 识别的表位在PRRSV 不同病毒株间的序列比对Fig.5 Comparison of the epitope recognized by the MAb among the different strains of PRRSV

3 讨 论

本研究利用PRRSV SD53 株感染Marc-145 病变后的细胞上清作为抗原制备MAb，与体外表达的蛋白相比，上清中的全病毒保持了病毒蛋白的天然构象，免疫原性强，免疫后产生的抗体更接近野毒感染所产生的抗体，以全病毒作为免疫原，免疫后更易产生能够被相应病毒阳性血清所阻断的MAb[9]。此外，本研究将全病毒感染的Marc-145 细胞与未接毒的Marc-145 细胞混合，经IFA 方法筛选杂交瘤细胞株，可以有效提高MAb 筛选的特异性。

N 蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20 %～40 %。与其它蛋白相比，N 蛋白保守性较高，其氮基酸同源性在美洲型PRRSV 之间为96 %～100 %，而其与欧洲型PRRSV 之间同源性仅为 56 %～59 %[10]。1H4 MAb 识别的抗原表位为aa107～aa123，导致该 MAb 无法与欧洲型 PRRSV病毒株该区域氨基酸特异性结合，因此1H4 MAb 仅特异性地与美洲型PRRSV 株反应。

研究者对PRRSV N 蛋白的二级结构预测分析，显示 N 蛋白的 β- 折叠区域位于 aa3～aa16、aa33～aa56、aa60～aa70 和 aa111～aa117，该区域很容易形成一种外显结构，表明N 蛋白上述区域更易形成抗原表位[11-12]。本研究经软件预测得到的1H4 MAb识别的N 蛋白抗原表位为aa111～aa117，而经鉴定得到该MAb 识别的最短抗原表位为aa107～aa123，从理论上也证明了N 蛋白中存在该MAb 的识别表位。研究显示，通过美洲型PRRSV 株的一组MAb与不同N 蛋白片段的免疫反应试验，鉴定了N 蛋白的5个抗原表位，分别位于aa30～aa52、aa37～aa52、aa52～aa69、aa69～aa112 和 aa112～aa123[13]。1H4 MAb 识别的抗原表位覆盖aa112～aa123，并与aa69～aa112 在107PTQHTV112有 6 个氨基酸的重叠。研究显示，删除美洲型PRRSV N 蛋白C 端11 个氨基酸后，几乎阻止了所有构象依赖的MAb 对其的识别，因此 C 端(aa112～aa123)可能对维持 N 蛋白的整体结构起着重要作用，且识别 N 蛋白 aa69～aa112 与aa112～aa123 抗原表位的 MAb 均未被报道具有被PRRSV 阳性血清阻断的能力[11]。Wang 等制备出的HP-PRRSV MAb 在进行阻断ELISA 试验时，阳性血清的OD450nm值随着血清稀释度的增加而升高[14]，而本研究中阳性血清的OD450nm值随着稀释倍数的提高而未发生明显变化，表明1H4 MAb 可以被低抗体水平的PRRSV 阳性血清所阻断，该MAb 的制备为建立高灵敏度的美洲型PRRSV 阻断ELISA 检测方法奠定了基础。