几种常用线粒体基因在多房棘球绦虫虫种鉴定中的应用现状及进展

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泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis, AE)是因感染多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis, Em)续绦期幼虫导致的严重人兽共患病，未经治疗的多房棘球蚴病10年的死亡率可达90%，有“恶性包虫病”或“虫癌”之称[1]。AE的传统诊断方法主要包括剖检和经典沉淀计数技术(sedimentation and counting technique, SCT)，但存在耗时、费力、操作误差大等弊端，近些年随着PCR扩增以及下一代测序技术(next generation sequencing method, NGS)的应用，使多房棘球绦虫线粒体基因(mtDNA)在棘球绦虫虫种鉴定中的应用越来越广泛，不仅克服了传统方法耗时、费力的缺点，而且可以承受大批量感染宿主的虫种鉴定工作，甚至将其应用到临床患者的诊疗中[2-3]。

长期以来，全世界相关领域学者从线粒体基因角度对多房棘球绦虫分布、多房棘球蚴病防、诊、治等进行探索并加以阐释。下面将近年来线粒体基因在多房棘球绦虫虫种鉴定方面的研究综述如下。

1 多房棘球绦虫mtDNA简介

多房棘球绦虫mtDNA是绦虫细胞除核基因外的另一重要遗传物质，全序列13 738 bp(来自AB018440.2)，为多拷贝序列，具有母系遗传特点，进化速度较核基因快，一般情况下无组织特异性，且易于获得，重复性好。与其他扁形动物门物种一样具有36个编码基因，其中蛋白质编码基因12个，tRNA编码基因22个，rRNA编码基因2个。蛋白质编码基因约占60%，编码产物为线粒体呼吸链的重要组分，主要包括细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase, CcO)基因(cox1、cox2、cox3)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶基因(nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5和nad6)、细胞色素b基因(cob)、ATP合成酶F0亚单位6基因(atp6)，缺少较高等动物具有的atp8基因，蛋白质编码基因一般无内含子，各编码基因之间可被tRNA基因或其他非编码序列间隔[4-6](如图1)。mtDNA所有基因均位于重链上，复制和转录按顺时针方向进行，与有体腔的后生动物双向进行不同。虽然多种mtDNA基因可用于虫种鉴定，但各个基因相互之间有一定区别[18](见表1)。

图1 多房棘球绦虫mtDNA排列顺序(未展示tRNA基因)Fig.1 The sequence of mtDNA ofEchinococcus multilocularis(no expressing tRNA genes)

表1 几种多房棘球绦虫mtDNA的特点[18]

Tab.1 Characteristics of various mtDNA markers

分子标记特点蛋白编码基因∗保守,用于家族、属、种等分类的鉴别12S rRNA高度保守,用于门、亚门水平的鉴别16S rRNA用于中间分类水平的鉴别,如家族等非编码区高度可变,用于种和亚种的鉴别

注：*包括cox、nad、cob及atp6基因；该表格内容主要参考文献[18]。

下面将分开叙述几种mtDNA在多房棘球绦虫虫种鉴定中的应用。

2 Em虫种鉴定中常用的几种线粒体基因

2.1cox1基因 多房棘球绦虫cox1全序列1 608 bp(来自AB461420.1)，一般位于mtDNA重链tRNATrp和tRNAThr基因之间[7]，该基因编码产物为细胞色素c氧化酶(CcO)亚基1，具有与血红素和铜离子配位的组氨酸，亚基1分子量较亚基2和3大，进化速度较快[8]。cox1基因不仅变异程度较大，能准确区分不同种间寄生虫序列差异，而且其保守区域可用于精确设计PCR引物[9]。2003年Hebert[9]提出cox1基因适用于多种动物的种类鉴别，富含多态位点的cox1片段可作为物种鉴别的DNA条码(DNA barcoding)。

研究者通过提取宿主粪便和病灶中的棘球绦虫cox1基因，能够快速、准确鉴别棘球绦虫虫种。Gérald[10]等在法国Em低发区红狐粪便中提取DNA，对cox1基因进行焦磷酸测序，发现东南部Hautes-Alpes省和北部Seine-Maritime区域Em感染率分别为2.5%和3.5%。研究者于法国东北部Moselle野生动物园内捕捉151只野鼠(voles)，解剖获取病灶组织并利用PCR扩增cox1基因用于Em调查，感染率5.3%[11]。Leidi[12]等爱沙尼亚寄生虫调查，解剖111只红狐，扩增组织cox1基因，Em感染31.5%。近些年cox1基因扩增方法如限制性片段长度多态性PCR(RFLP-PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、实时PCR(real time-PCR)、高分辨率溶解PCR(high-resolution melting, HRM-PCR)等应用广泛，使Em虫种鉴定的敏感性和特异性增加。Guilherme[13]等提出HRM-PCR扩增cox1基因可以使虫种鉴别更具特异性。cox1为Em虫种鉴定中应用最广泛的基因之一，其方便设计引物，扩增结果可信度高。

2.2nad1基因 全序列长894 bp(来自AB668376.1)，一般位于mtDNA重链tRNAAsp和tRNAAsn基因之间[7]，因多房棘球绦虫nad1基因存在特异的进化片段，在虫种鉴定中可区分同属但不同种的寄生虫。研究者对Em线粒体nad1进行扩增，所得结果与GenBank中收录的基因同源性达98.8%，与细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,Eg)基因的同源性约86%，与少节棘球绦虫(Echinococcusoligarthrus,Eo)、伏氏棘球绦虫(Echinococcusvogeli,Ev)的基因同源性约85%，指出Em的nad1基因序列与其他类型的棘球绦虫nad1序列存在差异，故而可依据差异片段设计区别不同虫种的引物，在未知类型寄生虫流行区筛查是否存在多房棘球绦虫感染[14]。Mohammad[15]等在伊朗西北部赞詹省进行的红狐肠内寄生虫鉴别实验，对nad1基因进行PCR扩增，发现该地暂无Em感染。除此之外，研究者通过nad1筛查Em发现了新的中间宿主。研究者在加拿大西南部Alberta地区，提取肝病灶组织DNA，扩增nad1，首次报道了红背鼠(Myodesgapperi)作为Em中间宿主[16]。虽然nad1扩增可鉴别Em虫种，但因抑制剂影响PCR扩增造成实验结果可靠性下降，C.Klein[17]等发现将冻融粪便样品用于扩增nad1基因，可以减少PCR抑制剂的影响，并且PCR敏感度提高20%。

2.312S rRNA基因Em线粒体12S rRNA基因和16S rRNA基因呈串联排列，中间被tRNACys基因隔开[7]，12S rRNA基因与16S rRNA基因相比更加保守，因此常用于分类水平较高的寄生虫虫种鉴定，可在多种寄生虫混合感染、多变且复杂的环境中鉴别虫种[18-19]。研究者在波兰东北部Varmia-Masuria省，Anna Lass[20]等地采集103份环境中的水果、蔬菜和蘑菇样本，利用巢式PCR(nested-PCR)扩增12S rRNA，发现野外环境中Em虫卵DNA阳性率23.3%。B. Szostakowska[21]等扩增线粒体12S rRNA基因的方法首次在波兰东北部Varmia-Masuria地区土壤中发现有多房棘球绦虫mtDNA的存在。另外，研究者将12S rRNA序列用于鉴别宿主种类和Em。Anke Dinkel[22]等提取来自不同宿主的犬类粪便DNA，扩增12S rRNA片段，表示实时多重巢式PCR(real-time multiplex-nested PCR, rtm-nested PCR)可同时检测犬类粪便中Em和宿主种类。

2.416S rRNA基因 16S rRNA基因与12S rRNA基因相邻，进化速度较12S rRNA快，用于Em虫种鉴定时常联合其他mtDNA。Li[23]等调查了来自中国西北地区53例包虫病患者，提取活检组织DNA，RFLP-PCR法扩增16S rRNA基因，cob基因测序，确定其中20例为AE患者。16S rRNA的不同扩增方法对Em检出率不同，周正斌[24]等采用多重PCR(multiplex PCR)、RFLP-PCR和半巢式PCR(hemi-nested PCR)分别扩增Em、Eg、Es和带科绦虫的16S rRNA，12 S rRNA和nad1基因，发现半巢式PCR阳性检出率最高，解决了PCR扩增抑制，再联合限制性酶切技术可提高Em鉴别的灵敏度和特异性。

2.5其他Em感染虫种鉴定时涉及的mtDNA 包括cob基因、nad2基因、nad5基因、atp6基因等，这些基因常常并不单独使用，而是与nad1、cox1等联用，从而提高虫种鉴定的准确性。Leidi Laurimaa[25]等采集爱沙尼亚浣熊肠道样本，扩增cox1、nad2和cob基因，首次报道了浣熊可能是爱沙尼亚感染AE的重要宿主，其感染率可达1.6%。Liu[26]等运用多重PCR扩增nad1、nad5、cox1片段，可区别Em、Eg和石渠棘球绦虫(Echinococcusshiquicus,Es)，特异性接近100%。

目前mtDNA主要用于终末宿主感染Em的筛查诊断，如利用粪虫体来源DNA聚合酶链式反应检测法(copro-DNA detection by PCR, Copro-PCR)扩增mtDNA，诊断Em敏感性89%～94%，特异性接近100%[27]。除此以外，中间宿主(不包括人)的诊断也可采用PCR扩增mtDNA联合剖检。虽然包虫病患者的诊断主要依赖临床病史、影像学结果、血清学检验以及病理学镜下特点，但也有部分研究者提取并扩增病灶组织mtDNA用于诊断泡型包虫病，MA[28]等通过cox1基因扩增调查青海地区棘球绦虫流行现状，发现163例包虫病人中AE感染率为10.4%。

mtDNA用于Em虫种鉴定，与经典SCT法相比较，降低了劳动量，减少了操作时间，避免了不同操作者的影响，尤其当使用SCT法难以辨别虫种时，依据不同分类水平特异性扩增所需mtDNA片段，在分子水平上比对Genbank中已存的绦虫线粒体基因序列，不仅虫种鉴别的敏感性和特异性接近SCT，同时也可根据mtDNA推测虫种来源和可能的传播方向。

3 存在的问题

虽然mtDNA广泛应用于Em虫种鉴定，但也存在很多局限。首先，1967年Rausch[29]以及2009年Minoru Nakao[30]对Em分类的建议还并未得到所有研究者的公认，还需进一步对Em虫株行统一分类，再加上Em虫株的多样，许多流行区域多种单倍型共存，某些新的单倍型被发现，PCR引物设计缺陷等，导致利用mtDNA进行Em虫种鉴定存在一些挑战。

其次，单纯使用mtDNA用于虫种鉴定忽略了核序列的变异情况[31]，如核内rRNA 基因、卫星DNA、RNA聚合酶II第二亚基基因(rpb2)、DNA聚合酶δ亚基基因(pold)等，某些核基因序列还可插入到mtDNA 中，干扰mtDNA序列分析结果[32]。建议在Em虫种鉴定时，多采用mtDNA和核基因序列对比分析法[33]，目的基因的选择不要局限于mtDNA中，多层次、多内容的分析结果可能具有更全面的说服力。

再者，mtDNA的全序列研究还较少，多数研究仅扩增mtDNA部分片段，导致所做结论说服力有限，难以客观指导疾病的预防和诊断。

最后，棘球绦虫mtDNA的提取及PCR扩增需要具备相关条件的实验室才能操作，对操作者也有较高专业技术要求，在部分落后地区难以普及。

4 结语

mtDNA在多房棘球绦虫虫种鉴定中有其独特的优势，可能在将来Em虫种鉴定中的应用将越来越广泛，与剖检、沉淀计数技术相互补充，提高虫种鉴定的准确性，但也存在一些缺陷，另外关于该基因表达产物的研究还没有深层次的展开，如何利用mtDNA准确鉴别多房棘球绦虫还需广大研究者不懈努力。

利益冲突：无

本文引用格式：王强, 王志鑫, 马艳艳, 等. 几种常用线粒体基因在多房棘球绦虫虫种鉴定中的应用现状及进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4):355-358. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.035