玉米杂交种新科891及其亲本SSR 指纹图谱的构建

张瑞平 周联东 王文洁 孙 佩 王 蕊 刘经纬 李和顺 王学军

（河南省新乡市农业科学院，新乡453000）

玉米杂交种和亲本遗传真实性是种子质量的重要标志之一，直接影响着玉米生产的产量和质量[1]。新品种逐年增加，高频率使用骨干自交系使品种的遗传基础趋于狭窄，加大了品种鉴定的难度[2]。同工酶和蛋白电泳多态性不够丰富，试验条件要求严格，鉴定结果稳定性低[3]，已经不能很好地鉴定种子的真实性和纯度。SSR 标记因具有快速、准确、信息含量高、呈共显性分离、易于分析、重复可靠等优点，在分析自交系亲缘关系[4-5]和杂交种纯度[6-8]等方面发挥了重要作用。赵久然等[9]建立了46 个玉米自交系和杂交种的DNA 指纹图谱数据库，为更好地鉴定种子的纯度和真实性提供了方便。

新科891 于2018 年通过国家农作物品种审定委员会审定，审定编号：国审玉20186115。本文利用SSR 分子标记技术，对新科891 及其亲本进行分析，构建SSR-DNA 指纹图谱，并将SSR 引物扩增的条带数字化，计算出现相同数字指纹图谱的概率，以期为更准确地鉴定该品种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 杂交种新科891 及其父本PHA458和母本S155 均由河南省新乡市农业科学院玉米课题提供。试验所用DNA 聚合酶、dNTP 购买于宝生物工程（大连）有限公司。用于SSR 分析的56对引物序列来自玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 将杂交种新科891 及其亲本PHA458 和S155 种子沙培，置于30℃培养箱暗培养。3 叶1 心时取叶片混样，用CTAB 的方法提取总DNA[10]，紫外分光光度计检测DNA 的质量和浓度，加水稀释至25ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 扩增体系及电泳分析 反应总体积为20µL，包 括dNTPs 0.2mmol/L、引 物0.25μmol/L 和 模 板DNA 25ng，加灭菌纯水补足体积。PCR 扩增程序为：94℃预变性5min；94℃40s，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。PCR 扩增反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR 仪上进行。在扩增产物中分别加入上样缓冲液6×Loading Buffer，混匀后各取3.5μL 在8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶通过银染显色。然后在胶片观测灯上观察电泳结果，用凝胶成像系统扫描图片或者用相机拍照保存图片。

1.2.3 指纹图谱构建及数字化 筛选带型清晰、稳定的引物构建杂交种新科891 的指纹图谱，并将指纹图谱数字化。在相同迁移率位置（分子量相同片段）有带记为1，无带记为0，建立数据库。根据公式P=1/2n计算相同指纹图谱有可能出现的概率[1，11]，式中“2”为相同迁移率位点上等位基因存在的“有”或“无”（数字化处理中用1 或0 表示）两种关系；“n”为等位基因的数目；2n为检测n 个等位基因时有可能涉及的所有自交系的个数。

2 结果与分析

2.1 SSR 引物筛选 从56 对分布于玉米10 条染色体上的SSR 引物中筛选出扩增带型稳定、重复性好的7 对引物，用于构建杂交种新科891 的指纹图谱，这7对引物分布在玉米的7 条染色体上，共检测出23 个等位基因，每对引物可检测出2～4 个等位基因，平均为3.29 个，片段大小在200～400bp 之间（表1）。

表1 用于构建新科891 指纹图谱的引物信息

2.2 指纹图谱构建 杂交种新科891 的指纹图谱如图1 所示，杂交种891 及其父母本由引物bnlg439w1、umc2007y4、umc2015k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg1702k1 以及phi0801k15 扩增的主条带大小在200～400bp 之间。这7 对引物所扩出的杂交种新科891 的主条带均是父本和母本主条带的叠加，很好地印证了SSR 分子标记共显性的遗传特点[12]。

图1 杂交种新科891 及其亲本SSR 指纹图谱

2.3 指纹图谱数字化 将筛选出的7 对引物扩增的片段数字化，并计算出杂交种新科891 及其亲本出现相同数字指纹图谱的概率（表2），以父本PHA458 为例，数字指纹由23 个顺序不同的数字构成，出现与其完全相同数字的概率为1.19×10-7（P=1/223），即在8.4×106（223）份自交系中，只有1 份自交系与上述指纹号码相同。由此可见，出现与之完全相同数字指纹的概率极低，这个数字指纹图谱是其特有的。同理，由这7 对引物构建的杂交种新科891 及其母本S155 的数字化指纹图谱也是特有的，可用于品种的真实性和纯度鉴定。

表2 新科891 及其亲本的数字化指纹图谱

3 结论

相对于其他标记，SSR 标记比较稳定并且随机性更强，能提供更多的遗传信息。同时SSR 标记检测简便、快捷，又是共显性标记，所以越来越多的应用在遗传多样性分析、遗传图谱构建、自交系系谱研究、杂交优势群和DNA 指纹图谱建立上[1]。本研究针对杂交种新科891 及其父母本，利用SSR 分子标记，从56 对引物中筛选出7 对重复性及稳定性好、带型清晰的引物，用于构建新科891 及其亲本的指纹图谱，并且将扩出的条带数字化，建立杂交种新科891 及其亲本的数字指纹图谱，计算出现相同指纹的概率均为1.19×10-7，概率极低。因此，这7 对引物构建的杂交种新科891 的指纹图谱是特有的，在生产上可随机选择1～2 对引物用于杂交种新科891纯度和真实性鉴定，可操作性强。