基于ISSR技术的茭白种质资源遗传多样性

王凌云，杨梦飞，李怡鹏，张尚法，郑寨生

(金华市农业科学研究院 蔬菜研究所，浙江 金华 321000)

茭白(ZizanialatifoliaTurcz.)，古称菰，为禾本科菰属多年生宿根性水生草本植物，原产于中国和东南亚[1]。古代采食其籽粒，作为粮食作物栽培。后因菰黑粉菌(UstilagoesculentaP.Henn.)侵染，在适宜条件下，茭白植株茎尖数节畸形膨大形成肥嫩的肉质茎，为人们所食用[2-4]。茭肉白嫩细腻、营养丰富、味道鲜美，是我国仅次于莲藕的第二大类水生蔬菜。除作为蔬菜食用之外，在中医学上，茭白性味甘、凉、滑、无毒，有止渴、开胃、除目黄、利大小便、预防高血压和动脉硬化等功效。

茭白因受黑粉菌侵染，不再开花结实而转化为无性繁殖，因此在茭白的栽培和选育种过程中，都是采用分株、分蘖等无性繁殖的方法。经过长期的选育种和地区间相互引种，目前，我国茭白品种资源丰富且类型各异。通常根据茭白品种的外观形态和农艺性状定向筛选茭白新品种，茭农也常常根据自身需求对茭白品种进行筛选。此外，茭农在茭白种植过程中普遍就近引种和自行命名，导致茭白品种上同种异名和同名异种问题严重，茭白品种间的亲缘关系比较复杂和混乱。上述问题对茭白产业的进一步发展产生了很大障碍，而形态鉴别很难确定品种或品系间的相互关系，因此在分子水平上明确茭白品种间的遗传差异就显得尤为重要。

目前分子标记已被广泛应用于植物遗传多样性分析与种质鉴定等方面。ISSR(inter-simple sequence repeats)分子标记是一种利用重复序列加选择性碱基为引物，对基因组DNA进行扩增的标记体系[5]，即用微卫星锚定引物退火至SSR区域，扩增出SSRs毗连区域，扩增产物经电泳分离获得指纹图谱，从而揭示样本间的遗传多样性。ISSR分子标记为随机引物，无需预先了解DNA序列，具有能够显示较高多态性、重复性高、易于操作、对基因组DNA的质量要求低等方面优点[6-8]。

本研究针对茭白种质资源和品种选育中存在的问题，应用ISSR技术对茭白品种的DNA多态性进行分析，以期从分子水平上探讨茭白品种间遗传背景的差异，为茭白种质资源与遗传育种研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为金华市农业科学研究院水生蔬菜资源圃保存的茭白品种和地方品系，共30份，具体为(1)金茭1号，(2)金茭2号，(3)嘉兴茭，(4)象牙茭，(5)三口冷水茭，(6)一点红，(7)美人茭，(8)天台茭，(9)十月茭，(10)温岭茭，(11)老竹茭，(12)吴岭茭，(13)湖州八月茭，(14)中秋茭，(15)浙茭2号，(16)龙茭2号，(17)浙茭3号，(18)嵊茭1号，(19)浙茭5号，(20)冬茭，(21)梭子茭，(22)黄岩双季茭，(23)小蜡台，(24)余杭茭，(25)浙茭911，(26)早茭，(27)白玉，(28)白种，(29)广益茭，(30)曲靖单季茭。采集植物材料时，全部采集生长期的幼嫩叶片，试验材料置超低温冰箱中保存备用。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测

每个材料称取新鲜幼叶50 mg，在-30 ℃预冷的研钵中用液氮迅速研磨成粉状，装入2 mL离心管中；在离心管中加入预热至65 ℃的2×CTAB提取缓冲液800 μL，加60 μL巯基乙醇混匀，65 ℃温浴30 min，其间混匀2～3次；取出样品待冷却至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，振荡混匀，12 000 r·min-1离心15 min；取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，振荡混匀，12 000 r·min-1离心15 min；取上清液加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20～30 min后，12 000 r·min-1离心15 min；将沉淀晾干后溶于200 μL TE，加入400 μL 95%乙醇、20 μL 3 mol·L-1NaAC，-20 ℃沉淀1 h，12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min，500 μL 75%乙醇洗涤，12 000 r·min-1离心10 min，加入30～50 μL TE溶解DNA，用质量分数0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量[9-11]。

1.2.2 ISSR引物

ISSR引物参照哥伦比亚大学UBC公布的96个ISSR引物序列，用提取的茭白DNA进行初步筛选。

1.2.3 PCR扩增

25 μL反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，引物0.5 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，无菌水19 μL。反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(每一条引物都有相应的最佳退火温度)45 s，72 ℃ 2 min，45个循环；72 ℃ 10 min。

1.3 数据统计与分析

按照电泳图谱同一位置上ISSR条带的有无进行统计，有条带的记为1，无条带的记为0，获得原始0、1数据矩阵，应用非加权组平均法(UPGMA)对试验材料进行聚类分析，建立聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR多态性

随机挑取3个品种茭白的基因组DNA对合成的ISSR引物进行筛选，从中筛选出8个扩增带型清晰、多态性适中的引物，用这8个引物对30份茭白材料进行多态性分析。扩增指纹图谱如图1～图4所示。从图片所显示的扩增条带上看，这些材料之间的差异并不大。每个引物可扩增出7～13条DNA谱带，平均每个引物扩增9.63条DNA谱带，8个引物共产生77条谱带，其中31条具有多态性，多态性比率为40.26%。引物U840多态性条带为5条，其余都只有2～4条；平均每个引物产生的多态性条带的数目为3.5条，多态性百分率介于18.18%～41.66%。

图1 引物U809和U810扩增结果

图2 引物U811和U827扩增结果

图3 引物U836和U840扩增结果

图4 引物U886和U889扩增结果

2.2 遗传相似系数和聚类

以30个茭白品种和77个位点的谱带数据为原始矩阵，用NTSYS2pc Version 2.10计算，获得了两两不同的品种间遗传相似性系数。结果表明，30个茭白品种的遗传相似系数GS为0.88～0.94。其中，遗传相似系数最大的是浙茭5号和浙茭2号，达到0.94，说明它们之间的亲缘关系较近，遗传差异小；曲靖单季茭和老竹茭与其他品种遗传差异较大，遗传相似系数分别为0.880和0.897。利用ISSR标记数据计算品种间的遗传相似性系数矩阵，采用UPGMA法构建了30份茭白品种间的遗传关系聚类图(图5)，以0.916为阈值可以把剩下28个茭白品种分为3组。第一组分为2个次级亚类，分别是金茭1号、金茭2号等4个单季茭和余杭茭、浙茭911、早茭3个双季茭，均是浙江本地品种和改良品种。第二组包括了浙江省近年来选育的大部分新品种，如龙茭2号、嵊茭1号、浙茭系列，同时包括了杭州地方资源和苏州地方资源，如梭子茭、美人茭、象牙茭、八月白、小蜡台等，它们具有较高的遗传相似性。第三组同样分为2个次级亚类，第一类天台茭、温岭茭、黄岩双季茭均来自浙江台州，第二类白玉、白种、广益茭全部来自江苏苏州，划分较为清晰，它们也具有较高的遗传相似性。

3 小结

品种间遗传关系研究和遗传多样性分析对于作物育种具有十分重要的意义[12]。茭白常采用形态标记进行分类，但茭白是菰与黑粉菌共生的产物，形态特征受环境影响较大，鉴定比较困难。DNA指纹图谱是遗传物质直接、直观的体现，不受生物体组织部位、生长周期、环境因素的影响。ISSR标记因其多态性高、稳定性强而得到肯定，在植物亲缘关系与遗传多样性分析中应用广泛。本实验在样品采集时选用幼嫩茭白叶片，排除了黑粉菌的干扰，因此实验结果能够准确反应茭白品种的遗传基础。

图5 30个茭白品种的UPGMA聚类结果

茭白DNA的扩增图谱差异不明显，多态性分析得出30份茭白品种资源的多态性条带百分率只有40.26%，可能在引物的筛选上还需改进。另一方面，供试材料的遗传基础狭窄，亲缘关系比较接近，这与其他研究报道结果相似[13-14]，可能与供试材料主要来源于浙江、江苏有关，两地都是茭白的主要产区，地域位置近，长期以来品种资源交流密切，目前大面积推广的品种都是基于两地地方品种改良而来。遗传相似度较高的茭白品种在栽培中表现出不同的外观特征和农艺性状可能是黑粉菌侵染过程中不同亚种作用引起的。