TLR4/MyD88介导的炎症反应在体外培养癫痫海马组织中的作用☆

叶洁梅 黄国雄 蔡志玲 伍桂雄 黄媛恒

近年来，癫痫与免疫相关的学说渐渐倍受关注，异常免疫反应可能是痫性发作和癫痫形成的始动因素之一，小胶质细胞、星型胶质细胞和神经元可作为免疫活性细胞，参与和影响炎症反应，TLR4是Toll样受体家族（Toll-like receptors,TLRs）受体家族重要成员，TLR4是小胶质细胞、星型胶质细胞和神经元的重要炎性受体，促进炎性细胞因子和免疫调控分子表达，影响癫痫的发生和进展，具体作用尚不十分清楚[1]。本研究拟体外观察大鼠海马癫痫组织中细胞TLR4介导的炎症因子IL-1β、IL-6和通路蛋白MyD88，进一步阐明癫痫发病中的炎症作用。

1 材料与方法

1.1 体外自发性癫痫样放电海马脑片模型制备取新生6～9 d SD鼠，用 75%乙醇浸泡消毒后，无菌条件下分离出完整的海马，置于无菌的3%琼脂块凹槽中，于振动切片机的载物平台上，4℃HBSS液中以400 μm厚度进行切片。在 6孔培养板内插入微孔滤膜，将完好的海马脑片分放在各孔内的滤膜上，各孔内加1.3 mL的完全培养液，置37℃、5%CO2、平衡湿度的条件下培养，每周半量更换培养液2次，倒置相差显微镜下观察生长情况，培养至7 d。人工脑脊液（artificial cerebral spinal fluid,ACSF） 成分 （mmol/L）：NaCI 124、KCI 3.3、KH2PO41.2、NaHCO326、CaCL22.5、MgSO42.4、葡萄糖10，PH 7.4。脑片在ACSF中通95%O2及5%CO2孵育至少1 h，实验时改用未加Mg2+ACSF（即无Mg2+ACSF）灌流 3 h，制备自发性癫痫样放电海马脑片模型，于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各时点收集样品进行检测。

1.2 qRT-PCR检测 于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各个时间点收取组织标本，冰上碾磨，提取海马组织总RNA（Invitrogen公司），电泳及紫外分光光度计鉴定纯度，根据逆转录试剂盒合成cDNA（Promega公司）。用SYBR Green荧光染料 （Bio-Rad公司），根据试剂盒说明书完成40个PCR循环，收集荧光信号并分析结果。每个样品均设3个复孔，采用公式2-△△CT计算各目的基因mRNA的表达水平。实验重复3次。

1.3 Western blot检测 于造模前后 1 d、3 d、7 d各时点，用蛋白提取试剂盒按操作说明提取细胞总蛋白,紫外线分光光度计测定蛋白浓度后煮沸变性，SDS-PAGE凝胶电泳，电转4 h至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入待检测蛋白单克隆抗体（Bioss、Abbkine 公司），4℃孵育过夜,洗膜3次，加入二抗，室温孵育 1 h，洗膜，显色曝光，分析TLR4和信号蛋白MyD88的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0进行分析，采用±s进行描述。数据符合正态分布，多个样本间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TLR4、MyD88、IL-1β 和 IL-6 mRNA 水平qRT-PCR结果显示，和造模前大鼠正常海马组织对照组相比，造模后1 d、3 d、7 d癫痫样放电海马脑片中各时间点TLR4、MyD88 mRNA的相对表达水平均明显增高（P＜0.001），同样，炎性细胞因子IL-1β和IL-6 mRNA的相对表达水平也明显增高（P＜0.001）（见图 1）。

图1 大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马脑片中T L R 4、M y D 8 8、I L-1 β和I L-6m R N A水平(与正常对照组相比，***P＜0.0 0 1)

2.2 TLR4和MyD88蛋白水平 Western blot结果显示，和造模前大鼠正常海马组织对照组相比，造模后 1 d、3 d、7 d各个时间点的 TLR4、MyD88 蛋白的表达水平均明显增高（P＜0.001）（见图 2）。

图2 大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马脑片中T L R 4和M y D 8 8蛋白水平

3 讨论

近年来，大量临床和实验研究证据表明，脑部炎症反应可能是痫性发作和癫痫形成的重要机制之一，癫痫发作后快速诱导的炎症反应，包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、血脑屏障内皮细胞和外周免疫细胞的活化以及局部炎性细胞因子的分泌，炎症反应同时也可诱导癫痫发作，促进海马发生病理性改变，如神经元损伤丢失、胶质细胞再生、苔鲜纤维发芽等[2-4]。TLR4在脑组织中主要表达于星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。目前国内外关于TLR4及其信号通路与癫痫关系的研究较少。MAROSO等[5]发现在海人藻酸致痫小鼠急性期和慢性期海马内 TLR4在 CA1、CA3、DG区星形胶质细胞和神经元上表达增多，TLR4基因敲除或TLR4拮抗剂处理小鼠能对抗海人藻酸所致的痫性发作。RODGER等[6]应用LPS对大鼠皮质进行研究，当LPS与TLR4结合后，诱发场电位的幅度增加3倍，并引发局部癫痫样放电，而此效应可以被IL-IR拮抗剂阻断。DAS等[7]对出生后2周的大鼠注射LPS，激活TLR4，诱发轻微的炎症反应，当这些大鼠成年后对海人酸、匹罗卡品或戊四氮诱发癫痫的易感性增加。本实验研究观察到体外新生SD大鼠海马神经元无镁细胞外液所致难治性癫痫模型中TLR4蛋白及mRNA增高，且随时间的延长而增强，与上述研究结果相一致。

MyD88是TLR4介导信号通路的重要胞内接头蛋白，具有负责募集下游信号分子的 N端死亡结构域（death domain，DD）和承接 TLRs活化信号的C端TIR结构域。TLR4与内源性配体如热休克蛋白、脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）等激活后，通过TIR结构域募集MyD88样接头蛋白MAL（MyD88 adaptor-like protein，MAL） 和 MyD88，与IRAK（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK） 家族蛋白分子结合成为信号转导复合物，后者磷酸化而脱离 MyD88/I-RAK复合体，结合并激活接头蛋白TNF受体相关因子（TNFR-associationfactor6,TRAF6），促使NF-κB由胞浆转移到胞核内，发挥转录调控作用，激活 IL-1β、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、补体、趋化因子等基因表达，最终导致炎症因子释放[8-11]。本实验结果显示，模型组大鼠癫痫样放电海马组织中，MyD88的mRNA和蛋白的升高，炎性因子IL-1β和IL-8 mRNA升高，表明其可能通过MyD88通路诱发炎症反应。

郑军（1971-），男，山东乳山人，博士，山东农业大学经济管理学院教授，主要研究领域：农业经济理论与政策。

综上所述，本研究表明，癫痫脑组织中的神经细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞膜表面表达的TLR4可作为受体，通过MyD88通路，引起炎症因子的分泌增多，可能是癫痫的异常免疫机制之一，免疫调节和抗炎治疗可能是癫痫治疗的潜在新靶点。