荔枝多糖的超声-微波提取工艺优化及其免疫调节作用

刘 洋 黄 菲 李巍巍 唐小俊 张瑞芬 张名位*

（1 华中农业大学食品科技学院 武汉 430070 2 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 农业农村部功能食品重点实验室广东省农产品加工重点实验室 广州510610）

荔枝（Litchi chinensis Sonn）是无患子科（Sapindacceae）荔枝属的常绿乔木，为我国华南地区的特色水果。其果肉味甜、多汁，富含多糖、酚类、膳食纤维等多种营养物质，具有较高药用价值[1]。据中医记载，荔枝果肉能够治疗或改善血气不足、失眠健忘、贫血、脾虚等症状[2]。现代研究发现，荔枝多糖是荔枝果肉的主要活性成分之一，具有抗氧化[3-6]，免疫调节[7-8]，降血糖[9-10]等作用。

基于荔枝免疫调节活性的机制研究及满足其精深加工的需要，多糖提取分离技术的改进至关重要。传统的植物多糖提取方法主要是热水浸提法[11-12]，虽然操作简单，使用仪器少，但是存在耗时长，提取率低等不足之处。随着现代分离技术的不断发展，植物多糖的提取也获得了较大突破。目前关于荔枝果肉多糖的提取仍多以热水浸提法为主。除此之外，董周永等[13]研究了家庭式微波炉对荔枝果肉多糖提取率的影响；陈卫云[14]和彭刚[15]分别探究了超声微波酶解协同技术对荔枝果肉多糖提取率及其清除自由基的影响。然而，针对超声-微波提取的荔枝多糖的体内免疫活性研究尚无报道。由于超声波的空化效应以及微波特有的热效应和机械效应，一方面，能够加速细胞壁组织破裂，促进多糖的溶出；另一方面，可能改变多糖的结构，从而引起其活性发生变化[16-17]。本研究采用响应面法优化超声-微波提取荔枝果肉多糖的提取工艺，并通过动物实验模型评价其体内的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

荔枝品种为“黑叶”，由广东省农业科学院果树研究所提供，2016年7月采摘于其实验园地。KM 小鼠和YAC-1 细胞由中山医学院实验动物研究中心提供。

DMEM 培养基、胎牛血清、HBSS 缓冲溶液，美国Gibco 公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、刀豆球蛋白A（ConA）、青链霉素，美国Sigma 公司；印度墨汁，德国Chroma-Gesellschaft 公司；其它试剂均为国产分析纯级。

CW-2000 型超声－微波协同萃取仪，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；EYELA N-1000旋转蒸发仪，日本东京理化器械；ZL-1 真空冷冻干燥机，上海医疗器械高等专科学校实验厂；FA-1104 电子天平，上海天平仪器厂；TDL-40B 离心机，上海安亭科学仪器厂；HEPA CLASS 100 CO2培养箱、MK3 353 酶联免疫检测仪，Thermo Labsystems；超净工作台，苏净集团江苏安泰空气技术有限公司；倒置显微镜，重庆光电仪器公司；UV-9100 紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

1.2 实验动物及前处理

实验小鼠分成2 批饲养，第一批用于血清溶血素水平的测定，第二批用于小鼠免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖和NK 细胞杀伤活性的测定。每批小鼠分为4 组：空白对照组（Control），多糖低剂量组（LP-50）、多糖中剂量组（LP-100）和多糖高剂量组（LP-200），每组10 只。低、中、高剂量多糖组分别每天灌胃50，100，200 mg/kg 的荔枝多糖（LP）溶液，空白对照组灌胃等量的生理盐水，连续给药28 d。

1.3 试验方法

1.3.1 荔枝多糖提取 荔枝干和荔枝果粉的制备参照黄菲等[18]的方法。

荔枝多糖提取：一定量的蒸馏水溶解称取的荔枝果肉粉末（质量为M），将其置于超声－微波协同萃取仪中反应一段时间后，趁热用纱布过滤，离心（4 800 g/15 min），取上清置于旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4，用95%乙醇醇沉（乙醇终浓度为80%），4 ℃冰箱静置24 h，离心 （4 800 g/15 min），将沉淀用80%乙醇、无水乙醇依次洗涤、抽滤，重复上述抽滤操作1 次，获得沉淀，真空冷冻干燥即得荔枝果肉多糖。

1.3.2 荔枝多糖提取率计算 将获得的多糖加水复溶至一定体积（V），采用苯酚-硫酸法测定其总糖含量C[19]。多糖得率按照如下公式计算：

多糖得率（%）＝C×V/M×100

式中，C——多糖质量浓度 （g/L）；V——多糖体积（L）；M——荔枝果肉粉质量（g）。

1.3.3 荔枝多糖提取响应面分析因素水平的选取依据中心组合原则，分别选取pH 值、功率、提取时间和水/料比4 个参数，在单因素试验的基础上采用4 因素5 水平的响应面分析法，以多糖得率为响应值（Y），以pH 值（X1）、功率（X2）、时 间（X3）、水/料比（X4）为自变量，具体设计见表1，试验方案及结果见表2。试验分为析因试验和中心点试验两部分，其中1-24 试验编号为析因试验，试验编号25-31 为中心点试验。31 个点分别为析因点和零点，析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复5 次以上，用来评估试验误差。

表1 响应面分析的因素与水平Table1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.4 血清溶血素测定 采用实验室前期建立的方法[20]，具体如下：实验结束前一周，每只小鼠腹腔注射5%（体积分数）的鸡红细胞（CRBC）悬液0.2 mL 进行免疫。7 d 后摘眼球取血，并收集于1.5 mL离心管中，2 500 r/min 离心20 min 分离血清。血清经生理盐水稀释150 倍后，取1 mL 加入2 mL 离心管中，再加入2%CRBC 悬液0.5 mL 和10%补体（豚鼠血清）0.5 mL，混匀。另以生理盐水代替血清作为空白调零。在37 ℃恒温箱中溶血反应30 min后，0 ℃冰水浴中止反应，1 800 r/min 离心5 min，并于540 nm 波长处测定上清液OD 值。同样，0.25 mL 的2%CRBC 悬液与1.75 mL 去离子水混合孵育测定CRBC 半数溶血（HC50）时的OD 值。实验小鼠血清中溶血素水平以HC50表征，即：HC50=样品OD/血清稀释倍数×CRBC 半数溶血OD。

1.3.5 免疫器官指数测定 实验小鼠颈椎脱臼处死后，将其完全浸没在75%乙醇中1～2 min，无菌条件下分离脾脏和胸腺，称重。按下式计算免疫脏器指数：

胸腺指数（%）=胸腺质量（mg）/体质量（g）×100

脾脏指数（%）=脾脏质量（mg）/体质量（g）×100

1.3.6 NK 细胞杀伤活性测定 脾细胞悬液的制备参照实验室前期的试验方法[21]。将获得的脾脏在无菌的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中剪碎，经灭菌的4 层医用纱布过滤吸取脾细胞悬液。以1 000 r/min离心5 min 沉淀脾细胞，弃去上清液，加入1 mL无菌水重悬细胞沉淀以裂解红细胞，30 s 后立即加入1 mL 的1.7%NaCl 溶液平衡细胞渗透压。细胞悬液于1 000 r/min 下离心5 min，弃去上清液后用适量的RPMI-1640 完全培养液（含10%胎牛血清）重悬，得单个脾细胞悬液。台盼兰染色计数活细胞数大于95%，以培养液调整脾淋巴细胞浓度为1×107cells/mL。以处于对数生长期的YAC-1 细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为2×105细胞/mL。以50 μL/孔向96 孔培养板中加入脾淋巴细胞悬液，作为效应细胞。每只小鼠来源的脾淋巴细胞均设6 个复孔，其中3 孔各加入50 μL 靶细胞作为试验孔，另外3 孔加入50 μL 培养液作为效应细胞对照孔。此外，设3 个靶细胞对照孔（50 μL 靶细胞和50 μL 培养液），100 μL 培养液孔用于调零。将培养板置于培养箱（37 ℃，5%CO2）中孵育4 h 后，每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT。继续培养4 h 后，每孔加入100 μL 酸性异丙醇，放置12 h。培养板轻微振荡混匀后，采用酶标仪于570 nm 下测定各孔OD 值，NK 细胞杀伤活性（%）=[靶细胞对照孔OD-（实验孔OD-效应细胞对照孔OD）]/100×靶细胞对照孔OD。

1.3.7 脾淋巴细胞增殖活性测定 将上述制备的脾细胞悬液调整浓度为5×106/mL，以90 μL/孔加入96 孔培养板中，每只小鼠来源细胞均设6 个复孔，其中3 孔各加入10 μL 的50 μg/mL ConA 作为刺激孔，另外3 孔各加入10 μL 培养液作为对照孔。另设100 μL 的培养液孔用于调零。将培养板置于培养箱（37 ℃，5%CO2）中培养68 h，每孔加入20 μL 的MTT（5 mg/mL）。继续培养4 h 后，每孔加入100 μL 酸性异丙醇，放置12 h。培养板轻微振荡混匀后，采用酶标仪于570 nm 波长下测定各孔OD 值[21]。

1.3.8 统计学处理 响应面设计采用SAS8.1 分析软件分析，动物实验采用SPSS11.5 统计软件单因素方差分析进行组间差异的比较，组间的两两比较采用S-N-K 检验 （the Student-Newman-Keuls test），显著性水平为P＜0.05，数据均以±s表示。图表中采用不同小写字母表示0.05 水平显著性差异。

2 结果与分析

2.1 荔枝多糖的提取工艺优化

2.1.1 响应面结果与分析 响应面设计各因素水平的荔枝多糖得率见表2。通过SAS8.1 进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：

对上述模型进行方差分析，结果见表3。从表3可以看出，回归模型P＜0.0001，说明回归模型达到极显著水平；失拟项P=0.16449＞0.05，不显著，说明该模型是合适的。模型复相关系系数的平方R2为0.9802，说明该方程拟合度较高，故该模型可以用于本工艺的实际推测。对各项F 值检验可知，各参数的二次项P＜0.01，为极显著影响，且微波功率和水/料比交互项P＜0.01，为极显著影响（表3）。各因子的贡献率为：X3＞X4＞X1＞X2，即提取时间＞水/料比＞pH 值＞微波功率。

2.1.2 优化与验证 依据所得模型，进一步确定各因素的最佳条件，求得优化的提取条件：pH 值为8.2，微波功率559 W，提取时间10.8 min，水/料比为22.7∶1，在此条件下多糖提取产率为24.33%。经3 次验证试验取平均值得实际荔枝多糖提取率

为24.02%，与理论值相比，相对误差为1.3%。由此说明，此法优化得到的荔枝果肉多糖提取工艺参数准确度高，对实际操作具有指导意义。

表2 响应面分析方案及结果Table2 Response surface analysis and results

表3 试验结果方差分析表Table3 Variance analysis of test results

2.2 荔枝多糖的免疫调节作用

2.2.1 血清溶血素 通过检测血清溶血素对细胞性抗原的响应表达，评价荔枝多糖LP 对小鼠补体系统的影响，结果如图1所示。与正常对照组相比，低剂量的荔枝多糖对小鼠的血清溶血素无显著影响（P＞0.05），而高剂量的荔枝多糖能显著提升血清溶血素水平（P＜0.05），具有促进小鼠补体免疫功能。

2.2.2 免疫器官脏器指数 小鼠的器官指数在一定程度上反应其免疫功能。荔枝多糖在50～200 mg/kg 范围内对小鼠脾脏指数无显著影响，而100 mg/kg 的荔枝多糖能显著增加小鼠的胸腺指数（P＜0.05）。

2.2.3 NK 细胞杀伤活性 为探究荔枝多糖对小鼠非特异性免疫状态的影响，本研究测定了各组小鼠中NK 细胞对YAC-1 细胞的杀伤活性。由图2可见，相比于对照组，各个剂量的荔枝多糖均能显著促进小鼠的NK 细胞杀伤活性 （P＜0.05），在100 mg/kg 的剂量下，NK 细胞的杀伤活性最大达到53.07%，是空白对照组的1.84 倍。

2.2.4 脾淋巴细胞增殖活性 脾淋巴细胞增殖对于激活细胞免疫和体液免疫活性都有重要影响。因此，试验分析荔枝多糖对淋巴细胞的影响，结果如图3所示。与空白组相比，不同剂量的荔枝多糖均能显著提高小鼠的血清溶血素水平 （P＜0.05），且100 mg/kg 荔枝多糖的促进效果最显著。

3 讨论

图1 荔枝多糖LP 对小鼠血清溶血素水平的影响Fig.1 Effect of LP on serum hemolysin production

表4 荔枝多糖对小鼠脾脏及胸腺指数的影响Table4 Effect of LCP on spleen and thymus index in mice

图2 荔枝多糖LP 对NK 细胞杀伤活性的影响Fig.2 Effect of LP on NK cell cytotoxicity

图3 荔枝多糖LP 对淋巴细胞增殖的影响Fig.3 Effect of LP on splenic lymphocyte proliferation

目前对于荔枝果肉多糖的提取分离方法，主要以常见的热水浸提为主。由于品种及操作方法不同，提取率也有所差异。多糖主要存在于植物细胞壁中[22]，是一类极性强的大分子化合物，结构复杂，易溶于水，水是最常用的提取溶剂，加热有利于加速多糖的溶出，故热水浸提法是最早也是使用最广泛的提取荔枝多糖的方法。唐小俊等和李雪华等[11-12]采用热水浸提法，有效提取出荔枝多糖，得率较低，分别为4.36%[23]和3.30%[24]。随着研究的深入，人们发现一些物理、生物方法可以加快细胞壁的破裂，因而在热水浸提的基础上出现微波、超声及酶解协同提取。董周永等[13]采用微波提取，得率为6.17%，其多糖含量为60.1%。吴雅静等[25]采用超声波辅助提取，提取率可达18.94%。酶解通过生物手段，依据细胞壁的构成，在相关酶的作用下，水解破坏细胞壁结构，释放多糖。陈卫云等[26]以微波酶解协同法提取荔枝多糖，提取率高达23.31%。本研究利用超声-微波萃取仪优化荔枝果肉多糖的提取工艺，所得荔枝果肉多糖得率约为24%，是热水提取法的5～6 倍，比单独的家庭微波炉或者超声波法的提取率明显提高，与微波酶解协同得率相当。

前期课题组研究发现荔枝果肉多糖具有显著的体外免疫活性调节作用，能够增加NK 细胞杀伤活性，促进脾淋巴细胞增殖以及加强巨噬细胞的吞噬作用[21]。在此基础上，本研究进一步探究了其体内免疫调节作用。结果表明，摄食荔枝多糖能够提高小鼠的血清溶血素水平，增加胸腺器官指数，促进NK 细胞杀伤活性以及刺激脾淋巴细胞增殖，从而得出，荔枝多糖具有显著的体内免疫活性调节作用。

有研究报道，随着灌胃剂量的改变，植物多糖对小鼠免疫调节作用呈双向调节现象，即在某一浓度剂量范围内植物多糖能够促进免疫活性作用增强，增加或减少剂量，活性明显降低[27]。本试验研究结果与此报道相似，中剂量组（100 mg/kg）的荔枝多糖对小鼠的免疫调节活性明显优于低剂量组（50 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg），由此可见，荔枝多糖也具有上述双向免疫调节作用。

4 结论

1） 采用响应面分析法优化荔枝果肉多糖的微波辅助提取工艺参数：pH 值为8.2，微波功率559 W，提取时间10.8 min，水/料比22.7∶1，在该条件下的多糖提取产率为24.02%。

2） 一定剂量的荔枝多糖可提高小鼠的血清溶血素水平、 胸腺器官指数、NK 细胞杀伤活性以及脾淋巴细胞增殖，表现出显著的体内免疫调节作用。