鱿鱼内脏多糖的分离纯化、理化性质及抗氧化活性研究

杨嘉梁 陈小娥，3 方旭波* 励建荣 马永钧 劳敏军

（1 浙江海洋大学食品与医药学院 浙江舟山316022 2 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁锦州121013 3 舟山市海大科学技术研究院 浙江舟山316041 4 浙江兴业集团有限公司 浙江舟山316101）

鱿鱼属软体动物门头足纲，又称枪乌贼或柔鱼，主要分布于大西洋、印度洋和太平洋等海域，是世界上三大未充分开发利用，且具有很大开发潜力的海洋生物资源之一[1-2]。秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）俗称美洲大赤鱿，是迄今为止发现个体最大、资源最丰富的鱿鱼种类之一，物产丰富，价格低廉，近年来，成为我国远洋鱿钓的重要捕捞对象[3]。

秘鲁鱿鱼的内脏约占总体重的15%～20%，是鱿鱼制品加工过程中的主要副产物，据市场调研发现鱿鱼内脏大都作为鱼粉加工企业生产鱿鱼膏的原料。然而，鱿鱼内脏中含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸、牛磺酸、微量元素以及多不饱和脂肪酸等营养物质[4]。国外对鱿鱼内脏活性物质的研究报道，主要为活性酶类的提取，如从鱿鱼肝胰腺中提取氨肽酶[5]，从鱿鱼内脏中提取消化酶[6]等；国内也有关于鱿鱼缠卵腺黏蛋白[7]、鱿鱼内脏糖蛋白[8]提取工艺的研究报道等。近年来，有学者发现一些海洋动物内脏多糖具有良好的抗氧化性，如鲍鱼性腺多糖[9]、单环刺螠内脏多糖[10]等。对头足类海洋动物内脏多糖的研究中，有学者研究报道了乌贼墨多糖，如吴金龙等[11]发现乌贼墨多糖对冷藏小鱿鱼有较好的防腐抗菌作用，罗萍等[12]研究了乌贼墨多糖的体外抗氧化活性，结果表明：在体外环境中，乌贼墨多糖抗氧化力明显。然而，国内外鲜有对头足类海洋动物产量最大的鱿鱼进行内脏多糖类活性物质结构或活性的报道，仅对鱿鱼内脏中占比较小部分的鱿鱼墨进行了研究，发现鱿鱼墨多糖能够改善小鼠肠道氧化应激损伤[13]，经过硫酸化修饰后的鱿鱼墨多糖具有抑制肿瘤转移的作用[14]。而资源量大的鱿鱼内脏中的多糖是否有类似于鱿鱼墨、乌贼墨多糖一样的抗氧化活性，亟需进一步研究。为了探究鱿鱼内脏多糖的抗氧化活性，充分挖掘鱿鱼内脏资源潜力，提高其附加值，本文对鱿鱼内脏中的多糖物质进行提取与抗氧化活性研究。

Liu 等[15]在文中指出多糖的抗氧化活性与其结构特征密切相关，例如：硫酸化程度、分子质量、主要的单糖种类、糖苷键的链接类型等。本文以秘鲁鱿鱼内脏为原料，提取其中的多糖类物质，并对鱿鱼内脏多糖进行分离纯化，研究其理化性质、结构组成以及抗氧化活性，探索鱿鱼内脏多糖结构、体外抗氧化活性及两者之间的构效关系，为进一步开发天然抗氧化剂，提高鱿鱼内脏附加值，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

新鲜秘鲁鱿鱼内脏，浙江富丹旅游食品有限公司，-20 ℃冰箱保存。

DEAE Sepharose Fast Flow，瑞典Amersham Biosciences 公司；Sephadex G-100、葡聚糖系列标准物（色谱纯），瑞典Pharmacia 公司；MD3544 普通型透析袋，上海源叶生物科技有限公司；标准牛血清蛋白、 考马斯亮蓝G-250、DPPH 试剂，美国Sigma 公司；单糖标准品 （色谱纯）、D-半乳糖醛酸、抗坏血酸（VC）等其它化学试剂，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

DS-1 高速组织捣碎机，无锡沃信仪器有限公司；UV-5900 型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂；LGJ-10 冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；AKTA Purifier 100 快速蛋白纯化系统，瑞典Pharmacia Biotech公司；Waters 2695 高效液相色谱仪 （配Waters 2695 示差折光检测器），美国Waters 公司；Nicolet 6700 红外光谱仪，美国Thermo Nicolet 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 取鱿鱼内脏200 g 自然解冻，去除鱿鱼墨囊及性腺，用高速组织捣碎机匀浆。

1.3.2 鱿鱼内脏粗多糖的提取 将上述鱿鱼内脏匀浆液，在100 ℃条件下，按料液比1∶20 浸提3 h。提取液5 000 r/min 离心10 min，取离心后的上清液50 ℃旋蒸浓缩至适量体积，然后加入4 倍体积的无水乙醇于4 ℃冰箱放置过夜。5 000 r/min离心取醇沉物，依次用无水乙醇、丙酮及无水乙醚洗涤，Sevag 法[16]除去蛋白杂质后装入透析袋（截留分子质量3.5 ku）透析48 h，冷冻干燥得到鱿鱼内脏粗多糖（Squid viscera polysaccharides，SVP）。

1.3.3 鱿鱼内脏粗多糖（SVP）的分离和纯化 取SVP 加去离子水配制成50 mg/mL 的溶液，0.45 μm 滤膜过滤，在AKTA Purifier 100 快速蛋白纯化系统上，采用平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析柱（2.6 cm×30 cm），依次用去离子水和0～1.0 mol/L 的NaCl 溶液梯度洗脱。上样量2 mL，流速1.5 mL/min，每管收集8 mL。以苯酚-硫酸法[17]隔管检测，绘制洗脱曲线。合并吸收峰处洗脱液，经浓缩、 透析后分别上样于Sephadex G-100 凝胶柱（1.6 cm×80 cm），去离子水洗脱，流速0.5 mL/min，每管收集6 mL，用苯酚-硫酸法逐管监测，绘制洗脱曲线。合并峰值处洗脱液，冻干后分别得到SVP-1 和SVP-2。

1.3.4 纯度及分子质量分布 SVP-1 和SVP-2的纯度及分子质量的测定采用HPGPC 法[17]，Waters 高效液相色谱系统，色谱条件：色谱柱为UltrahydrogelTM Linear （7.8 mm×30 cm）；柱温35℃；流动相为0.1 mol/L Na2SO4溶液；流速0.5 mL/min；样品溶液质量浓度为0.5 mg/mL；进样量20 μL。采用比旋光度法[18]鉴定两者极性均一程度，分别用质量分数60%和80%的乙醇沉淀SVP-1和SVP-2 的半饱和溶液，将所得沉淀配制成10 mg/mL 溶液，于20 ℃下测定比旋度。

1.3.5 热稳定性分析 差示扫描量热法参照佘志刚等[19]的方法，设置参数为：升温速率10 ℃/min，起始温度40 ℃，终止温度300 ℃，氮气为保护气，分析SVP-1 和SVP-2 的热稳定性。

1.3.6 基本组成分析 分别测定SVP、SVP-1 和SVP-2 的多糖含量：苯酚-硫酸法[17]；总蛋白含量：考马斯亮蓝（Bradford）法[7]；糖醛酸含量：硫酸-咔唑法[20]；硫酸基含量：氯化钡-明胶比色法[21]，每组数据至少重复测定3 次。

1.3.7 单糖组成分析 采用离子色谱法测定SVP-1 和SVP-2 单糖组成。样品经三氟乙酸（TFA），于121 ℃下水解2 h，去除TFA 后定容，对水解溶液稀释后进行单糖测定，色谱柱及色谱条件参照于青等[22]的方法。

1.3.8 红外光谱分析 SVP、SVP-1 和SVP-2 的红外光谱分析参照潘莹等[23]的方法：将1 mg 干燥样品分别与100 mg KBr 粉末混匀，经研磨后压片，在4000～400 cm-1波长范围内进行红外光谱扫描。

1.3.9 鱿鱼内脏多糖抗氧化活性分析

1.3.9.1 DPPH 自由基清除率的测定 按 照 文献[23]的方法，测定不同质量浓度SVP-1 和SVP-2 溶液的DPPH 自由基清除率，以VC 为阳性对照。

1.3.9.2 羟自由基（·OH）清除率的测定 以Fenton 反应[24]检测不同质量浓度SVP-1 和SVP-2 溶液清除·OH 的能力，以VC 为阳性对照。

1.4 数据处理

采用Origin Pro 8.0 软件绘图，试验结果用平均值±标准差表示（n=3），并利用SPSS 19.0 进行差异性检验和回归分析。

2 结果与分析

2.1 鱿鱼内脏粗多糖（SVP）的提取

鱿鱼内脏经水提醇沉法提取、Sevag 法脱蛋白、真空冷冻干燥得到淡黄色纤维状粗多糖SVP。初步测定其抗氧化活性，当SVP 质量浓度为10 mg/mL 时，DPPH 自由基清除率为（38.55±0.17）%，说明鱿鱼内脏粗多糖具有一定的抗氧化活性，为进一步研究其抗氧化活性，故对SVP 进行分离纯化、理化性质、结构组成等研究。

2.2 SVP 的分离和纯化

SVP 经过DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析后，洗脱曲线如图1所示。经去离子水和0～1.0 mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，得到3 个洗脱峰，峰1 和峰3 的多糖含量远高于峰2，因此分别将峰1 和峰3 的洗脱液浓缩、 透析后经Sephadex G-100 凝胶柱纯化，得到图2所示洗脱曲线。由峰1 得到单一对称峰，将洗脱液冻干后得到SVP-1；由峰3 得到2 个分离的峰，取多糖含量较高组分的洗脱液冻干后得到SVP-2。

图1 SVP 的DEAE Sepharose Fast Flow 洗脱曲线Fig.1 The elution curve of SVP on DEAE Sepharose Fast Flow column

图2 SVP-1 和SVP-2 的Sephadex G-100 洗脱曲线Fig.2 The elution curve of SVP-1 and SVP-2 on Sephadex G-100 column

2.3 SVP-1 和SVP-2 的分子质量及纯度

SVP-1 和SVP-2 经HPGPC 法分析得到图3所示的狭窄单一对称峰，表明两者分子质量集中且纯度良好。经计算可得SVP-1 和SVP-2 的分子质量分别为12.39 ku 和22.83 ku，SVP-2 的分子质量稍大于SVP-1，两者分子质量与鲍鱼性腺多糖[9]和单环刺螠内脏多糖[10]均较接近，同为小分子多糖。方旭波等[18]报道，当不同浓度醇沉多糖的比旋度一致时，其极性均一，纯度较好。在本试验中由不同质量分数 （60%和80%） 的乙醇分别沉淀SVP-1 和SVP-2 溶液，所得多糖沉淀的比旋度基本一致，室温20 ℃时，SVP-1 比旋度均在+8.5°左右，SVP-2 比旋度均在+23.4°左右。综上表明，SVP-1 和SVP-2 无论是分子质量还是极性都比较均一，纯度较好。

图3 SVP-1 和SVP-2 高效凝胶渗透色谱图Fig.3 The HPGPC chromatograms of SVP-1 and SVP-2

2.4 热稳定性分析

差示热量扫描仪检测出的曲线图在最大迁移点处显示样品的热变性温度。由SVP-1 和SVP-2样品的热变性曲线图（图4）发现：在温度40～300℃内，氮气流保护下，SVP-1 仅有一个吸热峰在154.4 ℃左右，表明SVP-1 由固体变成熔融状态，在154.4 ℃以前没有状态变化，性质稳定。236.5℃之后有一个放热峰，此时SVP-1 可能发生热分解。同理，SVP-2 只有一个吸热峰在116.5 ℃左右，表明SVP-2 发生熔融，而在300 ℃以内未出现热分解引起的放热峰，说明SVP-2 的热稳定性更好。由此可得，SVP-1 和SVP-2 在100 ℃内均无状态变化，热稳定性较好，有利于后续开发多糖产品，常温贮藏，保证产品质量。

图4 SVP-1 和SVP-2 的差示扫描量热法分析曲线Fig.4 Differential scanning calorimetry curves of SVP-1 and SVP-2

2.5 多糖基本成分分析

对分离纯化前、 后鱿鱼内脏多糖的基本成分进行分析，从表中数据可知：鱿鱼内脏多糖SVP 经过分离纯化后，其蛋白含量大大降低，SVP-1 和SVP-2 为纯化后的多糖，苯酚-硫酸法测得其多糖含量分别为83.39%、70.36%，均含少量蛋白，表明SVP-1 和SVP-2 结构中可能存在结合蛋白。组分SVP-1 不含糖醛酸和硫酸基，是一种中性多糖；组分SVP-2 糖醛酸和硫酸基含量分别为9.57%和7.06%，是一种含硫酸基的酸性多糖。

表1 鱿鱼内脏多糖的基本成分Table1 Chemical composition of polysaccharides from squid viscera

2.6 SVP-1 和SVP-2 的单糖组成分析

以9 种单糖标准品的离子色谱图 （图5）作为参考，SVP-1 和SVP-2 水解液中单糖的离子色谱如图6所示，对比发现：SVP-1 的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，物质的量比依次为11.6 ∶30.4 ∶22.4 ∶11.4 ∶13.9；SVP-2 的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，物质的量比依次为9.5 ∶23.7 ∶35.7 ∶16.2 ∶8.3。由此可知SVP-1 和SVP-2 均为杂多糖，两者单糖组成种类基本一致，比例存在一定差异，其中阿拉伯糖、半乳糖和木糖比例差异较大。SVP-2 与Ye 等[25]从海参中纯化得到的硫酸多糖AMP-2 的单糖组成基本一致，均以半乳糖为主要单糖组成。

图5 单糖标准品的离子色谱图Fig.5 Ion chromatogram of the standard solution of monosacchrides

图6 SVP-1 和SVP-2 水解液中单糖的离子色谱图Fig.6 Ion chromatograms of monosacchrides in hydrolysate of SVP-1 and SVP-2

2.7 红外光谱分析

对SVP，SVP-1 和SVP-2 分别做红外光谱分析，由谱图可知三者均具有多糖类物质的特征吸收峰（3 420，2 940，1 620，1 400，1 100 cm-1）[26]。其中3420 cm-1附近的强吸收峰为糖类O-H 的伸缩振动峰；2 940 cm-1附近的吸收峰是C-H 的伸缩振动峰；1 640 cm-1和1 400 cm-1附近的吸收峰分别为C=O 伸缩振动峰及C-H 变形振动峰。1 100 cm-1附近的吸收峰表明三者可能存在β-吡喃型糖环结构[27]。此外，SVP-2 中还含有1 238 cm-1及833 cm-1的吸收峰，前者源于S-O 的不对称伸缩振动，后者为C-O-S 对称伸缩振动峰[28]，再次证实SVP-2 中含有硫酸基团，是酸性多糖。

图7 SVP，SVP-1 和SVP-2 的红外光谱Fig.7 Infrared spectra of crude SVP，SVP-1 and SVP-2

2.8 抗氧化活性测定结果

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 对SVP-1 和SVP-2 做抗氧化活性检测，以VC 为阳性对照，检测DPPH 自由基清除能力发现：不同质量浓度的SVP-1 和SVP-2 对DPPH 自由基清除率差异显著（P＜0.05），表明两种样品的DPPH 自由基清除率随质量浓度的增大而显著增加，呈现出一定的剂量依赖效应；当质量浓度增大到一定值时，DPPH 自由基清除能力可与阳性对照VC 相当。回归分析得SVP-1 和SVP-2 对DPPH 自由基清除率的IC50分别为3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL。含硫酸基的SVP-2 清除DPPH 自由基能力略强于SVP-1，与Melo 等[29]报道的海参多糖结果一致，DPPH 自由基清除率为含硫酸基的多糖高于不含硫酸基的多糖，再次验证发现多糖硫酸化程度与抗氧化活性（DPPH 自由基清除率）有关。

2.8.2 ·OH 清除能力 为了多方面检测鱿鱼内脏多糖的抗氧化活性，本文对鱿鱼内脏多糖进行·OH 清除能力的检测。由图9可得：SVP-1 和SVP-2 对·OH 清除率也随质量浓度的增大而显著增加，具有一定的剂量依赖效应。回归分析得SVP-1 和SVP-2 对·OH 清除率的IC50分别为3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，两者能力相当。据Yuan 等[30]报道，·OH 清除活性与多糖中氨基酸基团的数量相关，SVP-1 虽无硫酸基团，但蛋白含量略高于SVP-2，因而含有较多氨基酸基团，提高了SVP-1 清除·OH 的能力。

图8 VC、SVP-1 和SVP-2 对DPPH 自由基的清除效果Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of VC，SVP-1 and SVP-2

图9 VC、SVP-1 和SVP-2 对·OH 的清除效果Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of VC，SVP-1 and SVP-2

通过对两种纯化多糖DPPH 自由基和·OH 清除能力的研究，可得出SVP-1 和SVP-2 的DPPH自由基清除率的IC50分别为3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL；·OH 清除率的IC50分别为3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，具有较高的抗氧化活性，可能是由于体外氧化自由基（DPPH 自由基和·OH 等）夺取多糖中的自由氢后失去氧化性，从而使鱿鱼内脏多糖具有较高的抗氧化活性。与乌贼墨多糖[12]的体外抗氧化活性相比，鱿鱼内脏多糖的体外抗氧化活性更高；鱿鱼墨多糖[13]可改善小鼠肠道氧化应激损伤，而鱿鱼内脏多糖具有体外自由基清除能力，表明两者均具有相类似的抗氧化活性。

3 结论

本文以秘鲁鱿鱼内脏为原料，经水提醇沉法提取得到SVP，SVP 经过DEAE Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 柱分离纯化得到2 个组分SVP-1 和SVP-2。由HPGPC 得 到SVP-1 和SVP-2 的分子质量分别为12.39 ku 和22.83 ku，20 ℃时比旋度分别为+8.5°和+23.4°，说明两种纯多糖分子质量集中、极性均一且纯度较好；SVP-1和SVP-2 在100 ℃以内热稳定性较好，有利于后续开发产品，常温贮藏；SVP-1 的多糖含量较高为83.39%，总蛋白含量为6.09%，不含糖醛酸和硫酸基，是一种中性多糖；SVP-2 多糖含量为70.36%，总蛋白含量为4.85%，糖醛酸含量为9.57%，硫酸基含量为7.06%，是一种含硫酸基的酸性多糖；红外光谱分析表明两者均具有多糖的特征吸收峰，且含有β-吡喃糖环结构，而SVP-2 还具有明显的硫酸基吸收峰；离子色谱法测得SVP-1 的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，物质的量比为11.6 ∶30.4 ∶22.4 ∶11.4 ∶13.9；SVP-2 的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，物质的量比依次为：9.5∶23.7∶35.7∶16.2∶8.3，组成两者的单糖种类基本一致，比例存在一定的差异；SVP-1 和SVP-2 对DPPH 自由基的IC50分别为3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL，对·OH 的IC50分别为3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，表明两种多糖均具有一定的抗氧化活性。

综上对SVP-1 和SVP-2 理化性质、结构组成及抗氧化活性的研究，可得出SVP-1 为中性多糖，SVP-2 为酸性多糖，且均与鱿鱼墨、乌贼墨一样具有较高的抗氧化活性，可为高值化利用鱿鱼内脏，开发鱿鱼内脏多糖类产品提供理论参考。