脂肪酸位置分布对婴幼儿奶粉油脂乳液体外模拟消化的影响

袁婷兰 伍文彬 朱雪梅 熊 华

（南昌大学食品学院 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

婴儿主要以母乳或婴幼儿配方奶粉为营养来源，其中脂肪是主要营养素之一，提供其生长发育所需大约50%～60%的热量[1]。母乳脂肪是以OPO为代表的TAG 结构，目前市场上多数婴儿配方奶粉添加植物调和油，使其脂肪酸组成接近母乳，然而，二者在脂肪结构上存在显著差异。植物油饱和脂肪酸如棕榈酸多分布于sn-1，3 位，不饱和脂肪酸大都分布在sn-2 位[2]。目前以OPO 型TAG（Triacylglycerol）分子结构为主的母乳脂肪替代脂（Human milk fat substitute，HMFS）是较传统婴儿配方奶粉的升级，也是目前乳品和油脂领域研究的热点。已有大量文献报道采用不同原料（如猪油、牛乳脂肪）以及不同方式合成HMFS[3-4]，对婴幼儿奶粉的研发，婴幼儿的健康成长有重大意义，然而其营养消化性有待评价。

不同结构TAG 同婴幼儿的消化、吸收以及代谢有密切关系。甘油三酯的脂肪酸种类和位置分布决定脂肪酸的吸收形式，胰脂肪酶的专一性，决定了脂肪酸的吸收形式2-MAG（Monoacylglycerol）或游离脂肪酸。因此母乳和奶粉TAG 脂肪酸位置的差异，对婴儿脂肪的代谢吸收至关重要。已有大量体内实验证明在婴幼儿配方奶粉生产中采用OPO 结构脂肪，可促进大鼠肠道对脂肪和钙的吸收[5-6]。然而其在胃肠道消化的具体机理还不清楚。近年来，体外实验由于其操作简单，成本低等优点，得到广泛应用。目前已有大量的研究者采用体外消化模型模拟人体胃、 肠道研究乳液脂肪的消化，且逐步发展[7-8]。Ménard 等[9]用一个新的模拟婴儿胃、 肠道的电脑系统控制的动力消化模型评价婴儿奶粉的消化性能。同课题组的Oliveira 等[10]用同样的体外动力消化模型研究了巴氏杀菌的母乳对足月新生儿消化过程中蛋白质和脂肪水解的影响。目前还有大量文献采用体外消化模型研究乳液的消化情况，多数考察了宏观上消化程度和速率的差异。为更深层地研究奶粉脂肪消化的影响机制，本文对普通型和OPO 型两种婴幼儿奶粉油脂制备的乳液进行体外模拟消化，比较其消化过程中的界面性质，消化产物中游离脂肪酸组成、甘油单酯组成以及微观结构的变化。以期为补充和完善脂肪消化机理，为有益于婴儿消化吸收的奶粉的设计开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

奶粉油脂，江西人之初有限公司馈赠。

脂肪酸甲酯混标GLC-463，NU-CHEK-PREP公司；BF3-甲醇溶液、胃蛋白酶、胃脂肪酶、猪胰酶，美国Sigma-Aldrich 公司；牛胆盐，西亚试剂；正己烷（色谱纯），美国天地试剂公司。

Nano-ZS 90 激光纳米粒度仪，英国马尔文公司；Agilent GC 7890（FID）气相色谱仪，美国安捷伦公司；GF254 薄层层析板，青岛海洋化工厂分厂；RH-A Basic 磁力搅拌器、Ultra Turrax T25 高速分散机，德国IKA 公司；Model 101 高压微射流，美国Newton 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 脂肪酸组成的测定 总脂肪酸组成测定：称取约2 mg 油样，加入1.5 mL 0.5 mol/L 氢氧化钠甲醇溶液，置于80 ℃水浴上回流5 min，冷却至室温，再加入2 mL 三氟化硼甲醇溶液，继续回流15 min，冷却至室温，用饱和氯化钠溶液清洗，加入2 mL 正己烷，振摇后，离心取上层清液，过无水硫酸钠柱子脱水干燥后，N2浓缩，用1 mL 正己烷溶解，装入进样瓶，采用气相色谱仪配有氢火焰离子检测器进行分析。将所得图谱与脂肪酸的混标比较对照，根据保留时间确定脂肪酸的种类，面积归一法定量确定各种脂肪酸的相对摩尔百分比含量。

sn-2 脂肪酸组成测定：根据胰脂酶水解TAG后得到游离脂肪酸和sn-2 MAG，采用薄层色谱分离其水解产物，刮下sn-2 MAG 条带，提取甘油单酯，将其甲酯化后进行气相色谱的分析。

1.2.2 乳液的制备 根据Giang 等[11]研究报道中所采用的乳液制备方法，稍作改动。

制备两种蛋白膜乳液，先将一定量的乳化剂（乳清蛋白∶酪蛋白酸钠=35∶65）溶于超纯水，恒温水浴中搅拌4 h 以上使充分溶解水化。将完全溶解水化的97%的蛋白溶液与3%奶粉油脂（普通型和OPO 型）混合搅拌5 min，然后经高速剪切分散机乳化3 min，再经20 MPa 高压均质处理，制备稳定的蛋白O/W 型乳液（1.0%乳化剂，3%油）。得到普通型和OPO 型两种结构油脂的乳液。

1.2.3 体外消化模型 本研究所用体外模拟消化水解模型，是以婴儿体内胃肠环境特点为基础，对前人研究中所用的婴儿体内脂类物质体外消化模型实验条件略做改动。

胃液的配制：模拟胃液 （SGF） 的配制，以Céline 等[12]报道的婴儿胃部消化特征，并参照Lueamsaisuk 等[13]的方法，进行一些改进。称取0.2 g NaCl，加1.3 mL 1 mol/L HCl，溶解于80 mL 去离子水中，用0.1 mol/L HCl 将溶液pH 值调至4.5，去离子水定容至100 mL。称取2.5 mg 胃脂肪酶和0.25 mg 胃蛋白酶加入2.5 mL 上述溶液，室温下磁力搅拌10 min 即为SGF。

小肠液的配制：模拟小肠液（SIF）的配制，以Claire 等[14]综述报道的婴儿肠道环境特征，参照Bosscher 等[15]方法，进行一些改进。称取8.78 g NaCl，0.37 g KCl，6.60 g CaCl2，用去离子水溶解，用0.2 mol/L NaOH 将溶液pH 值调至6.5，去离子水定容至1 L。称取5 mg 胆盐，10 mg 胰酶溶于10 mL 上述溶液，37 ℃下磁力搅拌10 min 即为SIF。

模拟消化：取10 mL 乳液于37 ℃水浴中恒温10 min；pH 值调至5.5，加入2.5 mL SGF，37 ℃搅拌，消化0.5 h，再用0.2 mol/L NaOH 将经过模拟胃液消化后的消化液pH 值调至6.5，加入10 mL模拟肠液，进行模拟小肠阶段的消化2 h，在此期间，不断滴加0.1 mol/L NaOH 溶液，使体系pH 值保持在6.5 不变，记录不同时间所消耗的NaOH的量。整个过程恒定温度37 ℃。每个样品进行至少3 次模拟消化试验。

1.2.4 消化过程游离脂肪酸释放率计算 根据消化过程中NaOH 溶液的消耗量来测定样品的脂肪酸释放。计算公式如下：

式中，C——NaOH 溶液的浓度 （0.1 mol/L）；V——t 时间消耗的NaOH 溶液的量（mL）；M——油脂的摩尔质量（g/mol）；m--加入的乳液中油脂的质量（g）。

1.2.5 乳液粒径和电位的测定 采用激光纳米粒度仪在25 ℃下测定乳液消化前和消化过程中的粒径和zeta 电位。

1.2.6 消化产物脂肪酸分析 消化样加入石油醚振荡分离得到醚层和水层，醚层脱去溶剂提取脂肪，经TLC 薄层色谱分离其水解产物（TAG，DAG，MAG，FFA），刮其对应的条带，采用GC 对FFA 和MAG 脂肪酸组成进行分析。

1.2.7 消化过程中乳液微观结构的变化 取1 mL 样品用10 μL 荧光染料尼罗红（0.01%）和固绿（0.01%）染色，充分摇匀；将染色后的样品滴加到载玻片上后盖上盖玻片，采用激光共聚焦显微镜观察。

1.2.8 数据分析 数据均用平均值±标准差表示，两组间比较用SPSS 16.0 软件中的独立样本t 检验分析，P＜0.05 为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 油脂脂肪酸组成分析

两种油脂中的TAG 脂肪酸组成及sn-2 位组成分布如表1所示，这对婴儿的营养有重大意义，与其在婴儿体内的消化吸收有很大关系。两者含量 大 于3%的 脂 肪 酸 为C18：1，C16：0，C18：2，C18：0，C14：0，C12：0。与邹孝强[3]所报道的人乳脂含量相比，主要的脂肪酸含量相似，还存在一些差异，奶粉油脂C18：2和C18：3的含量要比人乳脂肪高，且超长链的n3 多不饱和脂肪酸含量很少。两种油脂sn-2 位脂肪酸组成与人乳脂肪相比，发现OPO 型油脂除了C18：1略高，其它含量接近。而普通型油脂sn-2 位脂肪酸组成与人乳脂肪差别较大，其饱和脂肪酸（SFA）含量低于人乳，主要是C16：0显著低于OPO型油脂和人乳，而UFA 在sn-2 含量均高于人乳。由于OPO 型油脂sn-2 位上PUFA-3 含量较低，普通型油脂C18：2n6含量较高，使两者n6/n3 值超出人乳范围（1.97-7.18）。

表1 奶粉油脂的脂肪酸组成以及sn-2 脂肪酸组成Table1 Fatty acid distribution and composition of the fat for infant formula

2.2 乳液体外模拟消化过程中消化曲线的分析

试验分别测定了不同消化时间内 （0～150 min）模拟胃消化30 min（图1a 和1b）及肠消化120 min （图1c 和1d）乳液的FFA 释放率，以比较其在消化过程中的消化速率和消化程度，结果见图1。

图1 普通型和OPO 型油脂乳液体外模拟消化过程中的FFA 释放率Fig.1 The percentage of FFA released of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion

由图1可知，整个消化过程中，两种乳液在胃消化期FFA 释放率随时间上升；肠消化阶段的消化曲线呈“先快后缓”的上升趋势，初期两种油均快速水解，FFA 释放率上升较快，消化速率快；随着时间的延长，45 min 后，消化速率明显降低，曲线逐渐趋于平缓。这说明有消化产物积累在油滴表面，产物积累的速率大于脱离的速率，阻碍了脂肪酶与油脂的接触，从而抑制了水解反应。

比较两种乳液的消化曲线可知，在胃消化阶段，OPO 型油脂乳液较普通型油脂乳液消化程度高，这很可能与二者粒径、脂肪酸组成有关。初始胃消化阶段，OPO 型油脂乳液平均粒径较小，在油水界面处有更大的接触面积，容易与脂肪酶结合，表现出胃消化阶段较高程度的水解反应。然而，模拟肠消化阶段最终普通型油脂乳液消化程度比OPO 型高。从脂肪酸组成来看，OPO 型油脂的sn-2 位主要是饱和脂肪酸，普通型油脂的不饱和脂肪酸则主要分布在sn-2 位，而水解脂肪的胰脂肪酶是sn-1，3 特异性酶，以此推测OPO 型油脂乳液消化程度更高，图中结果却相反。出现这种结果的原因可能是二者脂肪酸碳链长度和不饱和度差异带来的影响。其一，较OPO 型油脂，普通型多不饱和度高，不饱和度的增加，加速了油的消化，有研究证实多不饱和脂肪酸有更高的消化性[16]。其二，中链脂肪酸比长链脂肪酸水溶解性更好[17]，OPO型油脂长链脂肪酸量较高，从而使其水解程度较低。徐俊杰[18]比较猪油和可可脂在体外模拟消化过程中的消化程度也得到类似结果，解释油滴上吸附脂肪酸后表面微环境的pH 并不完全处于中性状态，可能有酰基迁移的影响。

2.3 乳液体外模拟消化过程中粒径的分析

OPO 型油脂乳液和普通型油脂乳液消化过程中平均粒径的变化如图2所示，整个消化过程中，两种乳液平均粒径都是先增大后降低再增大。胃消化反应开始，水解酶吸附在油滴表面，替换或水解了部分蛋白，使平均粒径相对增加；进入肠消化阶段后，随胰酶和胆盐加入，水解反应迅速加快，继续替换界面组成，粒径大幅增加。相对于普通型油脂，OPO 型油脂水解释放较多的不饱和脂肪酸，更容易从表面除去，呈下降趋势。随着反应的进行，脂肪酸在油滴表面大量吸附，其速率大于脱离速率，抑制酶解反应的进行，颗粒发生絮凝和聚集，导致平均粒径增加。

2.4 乳液体外模拟消化过程中zeta 电位的分析

两种乳液初始电位表明二者均稳定，消化过程zeta 电位变化趋势大致相同，均呈先升高后略降低的趋势。对比图3发现，OPO 型油脂乳液电位升高得更快，结合其平均粒径变化结果，可能先是水解产物、胆盐的混合胶粒附着在油滴表面，后是吸附了小分子的非离子型表面活性物质如蛋白酶水解蛋白生成的氨基酸。电位的变化说明油滴表面组成发生了改变，消化过程中油滴表面重复着胆盐、水解产物等的附着和脂肪酶的替换。

图2 普通型和OPO 型油脂乳液体外模拟消化过程中【胃30 min（G30）；肠30，60，90，120 min（I30，I60，I90，I120）】平均粒径变化Fig.2 The average particle size of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion [gastric 30 min （G30）；intestinal 30，60，90，120 min （I30，I60，I90，I120）]

图3 普通型和OPO 型油脂乳液体外模拟消化过程中【胃30 min（G30）；肠30，60，90，120 min（I30，I60，I90，I120）】zeta 电位的变化Fig.3 The zeta potential of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion [gastric 30 min（G30），intestinal 30，60，90，120 min （I30，I60，I90，I120）]

2.5 乳液体外模拟消化后甘油单酯和游离脂肪酸的组成分析

图4显示了两种乳液体外模拟胃肠消化后，油脂水解释放的FFA（图4a）和产物MAG（图4b）脂肪酸组成。二者水解生成的游离脂肪酸和甘油单酯的种类基本相同，FFA 主要是油酸（C18：1）、棕榈酸（C16：0）、亚油酸（C18：2）和硬脂酸（C18：0）；MAG 主要是棕榈酸甘油酯、油酸甘油酯、亚油酸甘油酯和肉豆烯酸甘油酯。此外，OPO 型油脂生成的C18：1和C18：0相 比 于 初 始 酰 化 基 团 的 比 例 增 加，C16：0相对减少；Oliveira 等[10]研究母乳消化过程中脂肪酸的组成也是类似的结果。然而，普通型油脂正与之相反。OPO 型油脂的不饱和脂肪酸主要分布在sn-1，3 位，普通型的UFA 则主要在sn-2 位，根据文献所报道的体内实验结果[5-6]以及脂肪酶的水解特异性，推测模拟胃肠消化后，普通型油脂生成较多的饱和游离脂肪酸和不饱和脂肪酸甘油单酯，OPO 型油脂生成的游离不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸甘油单酯含量较高，与图中结果一致。OPO 型的水解生成O（C18：1），而P（C16：0）以甘油单酯形式被优先吸收，体现在所测的sn-2 棕榈酸甘油酯含量较高；而普通调和油型的生成P，因其熔点（63.1℃）高于体温且容易与矿物质形成沉淀，造成能量的损失，不利于人体消化吸收。

图4 普通型和OPO 型油脂乳液体外模拟胃肠消化后游离脂肪酸（a）和甘油单酯（b）的脂肪酸组成Fig.4 Fatty acid composition of the free fatty acid （a） and of the sn-2 monoglycerides （b） during the gastro-intestinal lipolysis of the control emulsion and OPO emulsion in vitro digestion

2.6 乳液体外模拟消化过程中微观结构的分析

如图5所示，对比二者，初始乳液，普通型出现一些较大颗粒，可能是因为其油脂熔点较OPO型低，被蛋白包埋的油脂发生迁移，导致乳液有絮凝和聚集现象[19]。普通型乳液在胃消化阶段相对变化不大，很少量的絮凝，甚至没有。而肠消化120 min 后，小粒子聚集，出现絮凝。OPO 型油脂在胃阶段消化30 min 出现絮凝，结合上述脂肪酸的释放率和粒径结果，说明出现这种现象主要由于反应释放的产物在油滴表面附着，与初始乳化剂发生竞争性吸附，导致粒子间空间位阻降低，容易结合在一起形成大粒子。肠消化120 min 后，絮凝被打破，而发现有油滴粒子间融合成大粒子现象，导致平均粒径的增大。

两者饱和与不饱和脂肪酸比例接近，这说明脂肪酸在甘油三酯的位置分布，对消化体系的稳定性有影响。相比OPO 型油脂，普通型油脂水解后主要生成更多的棕榈酸和较少的油酸，棕榈酸被中和后形成的脂肪酸钠盐，既对油滴有更强的附着力，造成体系不稳定，同时它也易与钙离子形成沉淀，而油酸被中和后易溶于水，不会过多附着在油滴表面。此外，油酸的熔点（16.3 ℃）比棕榈酸（63.1 ℃）熔点低，更容易引起油滴间聚集[19]。可见二者释放出来的脂肪酸差异，影响其油滴表面的界面结构。

3 结论

体外模拟消化过程中FFA 释放率曲线表明，模拟胃消化30 min，普通型油脂乳液的消化程度大于OPO 型油脂乳液，而胃肠最终消化程度普通型油脂乳液消化程度大于OPO 型油脂乳液。消化过程中，OPO 型油脂乳液zeta 电位值要高于普通型油脂乳液，平均粒径和微观结构图像表明，消化中OPO 型油脂乳液先出现絮凝聚集。胃肠模拟消化后普通型油脂生成较多的饱和游离脂肪酸和不饱和脂肪酸甘油单酯，OPO 型油脂生成的游离不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸甘油单酯含量较高。综合消化过程中平均粒径、 电位变化以及共聚焦显微图像说明脂肪酸的位置分布不同，水解产物不同，物化性质不同，会影响消化中油滴的界面组成，微观结构变化，从而影响其油脂的消化利用。

图5 普通型和OPO 型油脂乳液及其体外模拟胃消化30 min（G30 min）肠消化120 min （I120 min）的微观结构变化Fig.5 The confocal laser scanning microscopy images of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion