杨梅多酚提取物对高糖损伤INS-1细胞活性及Pdx-1表达的影响

戚向阳 孟 珂 章 棋 刘合生 柳云丽 喻柯柯 陈秋平 曹少谦

（浙江万里学院生物与环境学院 浙江宁波315100）

Ⅱ型糖尿病是一种典型的代谢综合症，可诱发机体多种代谢异常。有研究表明，胰岛β 细胞功能受损和凋亡是糖尿病发病的主要诱因[1-3]，而糖脂毒性是损伤胰岛β 细胞功能的重要原因[4-5]。研究表明，高糖损伤胰岛β 细胞的机制之一是抑制胰岛素基因转录因子Pdx-1 的活性及其表达水平[6]。Pdx-1 在胰腺发育、胰岛β 细胞分化及维持成熟胰岛β 细胞正常功能方面起着关键作用，可调节胰岛β 细胞葡萄糖激酶基因、 葡萄糖转运子GLUT-2 的表达[7]。Pdx-1 表达受损可诱发高血糖及血脂异常[8]。动物实验[9]表明，糖尿病鼠的持续高血糖可明显抑制Pdx-1 基因和胰岛素基因表达，降低Pdx-1 转录因子与胰岛素基因启动子结合能力，降低胰岛素分泌量。此外，Pdx-1 还调控其它与胰岛素分泌相关基因的表达，影响β 细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能（GSIS）及胰岛素分泌时相的改变[10]。上调Pdx-1 蛋白表达，减弱INS-1细胞糖脂毒性，是保护胰岛β 细胞和缓解糖尿病患者症状的一种有效途径。

目前市场上降糖药物种类繁多，可是均对人体具有一定毒副作用。有研究发现许多天然产物，尤其是多酚类化合物具有明显的降血糖作用。如茶多酚可以降低餐后高血糖，调节血脂，缓解胰岛素抵抗[11]。天竺桂提取物中的B-型多酚具有一定的降血糖活性，可保护棕榈酸或H2O2诱导损伤的INS-1 细胞。杨梅花色苷能减少H2O2诱导的胰岛INS-1 细胞的凋亡和坏死，减少细胞内过量ROS的产生，同时能减少自噬性细胞的死亡[12]。然而，有关杨梅多酚化合物对高浓度葡萄糖诱导的胰岛β 细胞凋亡和功能受损的保护作用尚未见有关文献。本文以胰岛β 细胞INS-1 细胞作为试验对象，探讨杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞损伤的保护作用以及对Pdx-1 转录因子表达水平的影响，为天然安全的降糖功能因子的筛选提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

INS-1 细胞，上海基免实业有限公司。RPMI 1640 培养基，北京Hyclone 公司；β-巯基乙醇，美国Gibco 公司；丙酮酸钠、 葡萄糖、MTT、Hoechst 33342、吖啶橙（PI）、台盼蓝及胰蛋白酶，美国Sigma 公司；胎牛血清，北京全式金生物技术有限公司；二甲亚砜（细胞培养级），北京索莱宝科技有限公司；青霉素-链霉素溶液，江苏碧云天生物技术研究所；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、细胞与组织裂解液（P1003）、actin 抗体、Pdx-1 抗体（Cell Signaling Technology）、HRP 标记山羊抗小鼠lgG （H+L）、Anti-rabbit lgG HRP-Linked 抗 体 及30%Acr-Bis（29∶1），江苏碧云天生物技术研究所；脱脂奶粉原产地美国；NaCl 注射液（生理盐水）、定影粉、显影粉、四甲基乙二胺、超敏发光液、甲醇、吐温20、正丁醇、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、二甲亚砜、异丙醇等，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器及设备

CO2培养箱，日本三洋公司；荧光倒置显微镜，日本Nikon 公司；96 孔板离心机及自动混匀器，德国Eppendorf 公司；通用酶标仪，美国Thermo 公司；电泳仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 杨梅多酚提取物的制备 称取一定量的杨梅果实，去核，以质量体积比1∶2 的比例加入丙酮溶剂，利用超声波溶剂提取法重复提取3～4 次，至提取液颜色几乎为白色，旋蒸去除溶剂。再以60%的乙醇水溶液为洗脱剂过LXA-8 大孔树脂，收集洗脱液，再旋蒸去除洗脱剂，冷冻干燥得杨梅多酚粗提物粉末。其总酚含量为65.52%。

1.3.2 细胞复苏及培养 取出液氮罐中冻存的胰岛INS-1 细胞于37 ℃水浴中快速解冻。无菌条件下打开螺盖，将细胞吸入无菌离心管中，加1～2 mL 含10%胎牛血清的培养液，1 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，加5 mL 培养液重悬，反复吹打成单细胞悬液，将细胞置于含有10%胎牛血清的INS-1 专用培养基中，于37 ℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满培养瓶底面的70%～90%时，即可以用0.125%的胰蛋白酶消化，传代扩大培养。

1.3.3 MTT 法检测INS-1 细胞活性 取一定量细胞培养液，在待测细胞培养板中每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 至有蓝紫色结晶析出，3 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，每孔加入100 μL 二甲亚砜，400 r/min 振荡10 min使甲瓒结晶溶解，酶标仪检测492 nm 波长处的吸光度。按下式计算细胞成活率：

细胞成活率（%）= OD 值/OD0值×100

式中，OD——不同处理组的吸光值；OD0——对照组的吸光值。

1.3.4 Hoechst 33342/PI 双染观察INS-1 细胞凋亡和坏死 取一定量细胞培养液，弃上清液，用PBS 清洗2 次，每次3 min。分别加入500 μL 5 μg/mL Hoechst 33342 和500 μL 5 μg/mL PI 工作液，室温孵育15 min。染色后磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2 次，每次3 min，吸弃上清，荧光显微镜观察：用紫外光滤光片 （UV） 观察Hoechst 33342 染色情况，凋亡细胞呈亮蓝色荧光，正常细胞呈弱蓝色荧光。用绿光滤光片（G）观察PI 染色情况，晚期凋亡和坏死细胞呈亮红色荧光，正常细胞呈现弱红色荧光。

1.3.5 高糖及杨梅多酚提取物对胰岛细胞活性的影响 取对数生长期细胞，调整细胞浓度，按1.2×104cell/孔接种于96 孔板，CO2培养箱中5%CO2，37 ℃培养24 h，吸去培养液。分别设置对照组（CON）、不同浓度的高糖损伤组（HG 组），不同浓度的样品组（Sample）。根据试验分组对细胞进行干预，其中，CON 组：加入200 μL 完全培养基；HG组：加入200 μL 不同浓度（16，20，25，40 mmol/L）HG；Sample 组：分别加入200 μL 0.1～200 μg/mL的杨梅多酚提取物。然后置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养一定时间，每组设3 个平行。各组细胞培养结束后，按MTT 法检测INS-1 细胞活性。

1.3.6 杨梅多酚提取物对糖毒性损伤细胞活性的保护作用 分别设置对照（CON）组、高糖模型组（HG 组）、样品（Sample）组，并根据试验分组对细胞进行干预。CON 组：加入200 μL 完全培养基；HG 组：加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 完全培养基，使体系中HG 终浓度25 mmol/L；Sample 组：分别加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 初始质量浓度为1，2，6，10，20，40 μg/mL 杨梅多酚提取物，放置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养48 h，每组设3 个平行。各组细胞干预结束后，按MTT 法测定INS-1 细胞活性。

1.3.7 杨梅多酚提取物对糖毒性损伤细胞凋亡和坏死的影响 取对数生长期细胞，调整细胞浓度，按2×105cell/孔接种于12 孔板，于CO2培养箱中5%CO2，37 ℃培养24 h，吸去培养液。分别设置对照 组（CON 组）、高糖模型组（HG 组）、样品组（Sample 组），根据试验分组对细胞进行干预：CON组：加入2 mL 完全培养基；HG 组：加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 完全培养基，使体系最终含25 mmol/L HG；Sample 组：分别加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 初始质量浓度为1，2，6，10，20，40 μg/mL CBE。放置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养48 h，每组设3 个平行。各组损伤结束后，按Hoechst 33342/PI 双染法观察细胞。

1.3.8 Western blot 检测Pdx-1 蛋白的表达 按2.7 方法进行试验分组并对细胞进行干预，各组损伤结束后，弃上清液，用PBS 清洗2 次，每次约3 min。每孔分别加入100 μL 细胞裂解液，反复吹吸使细胞充分裂解，全部吸出，置于冰上冻融30 min，然后在4 ℃、13 000 r/min 离心30 min，离心后取上清液按BCA 试剂盒法分析蛋白质含量。

采用BIO-RAD 电泳仪进行SDS-PAGE 电泳，聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，在凝胶的一端加样孔内加入预染蛋白分子Marker，在中间各孔加入8～20 μL 蛋白样品，每孔总蛋白上样量保持一致，采用60 V 恒压进行浓缩胶电泳，90 V 恒压进行分离胶的电泳。然后通过转印系统使蛋白从凝胶上转移到硝酸纤维素膜（NC）上，置于5%脱脂奶粉中室温封闭0.5～1 h。加一抗（小鼠Pdx-1 抗体，稀释比例为1 ∶1 000）4℃孵育过夜后，弃一抗，用TBST 洗膜1 h。再加二抗（HRP 二抗，1 ∶1 000）室温孵育1 h，弃二抗，用TBST 洗膜1 h。加入ECL 化学发光液，避光显色至出现条带时立即放入双蒸水中终止反应，用凝胶成像分析系统进行扫描分析。

2 结果与分析

2.1 高糖对INS-1 细胞活力的影响

如图1所示，不同浓度的高糖均能显著降低INS-1 细胞的成活率，且成活率随高糖浓度及损伤时间的变化呈现出不同的变化。INS-1 细胞用16，20，25，40 mmol/L 的高糖溶液损伤36 h 后，与对照组相比，细胞活力随着高糖浓度的升高逐渐下降。当INS-1 细胞用HG 损伤48 h 后，细胞活力分别为82.323%±2.71%，74.319%±3.209%，70.811%±3.279%，44.341%±0.918%。MTT 试验结果证明了高糖刺激导致INS-1 细胞的活性受到抑制和影响。采用高糖浓度25 mmol/L 损伤48 h 时，细胞的损伤达到30%左右，若损伤时间进一步延长，虽然细胞活力进一步降低，但对对照组影响较大，营养物质的消耗会导致细胞凋亡。因此综合试验结果，选择25 mmol/L，HG 损伤48 h 作为高糖模型的试验条件。

图1 高糖对INS-1 细胞活力的影响Fig.1 Effects of high glucose on INS-1 cell viability

2.2 杨梅多酚提取物对INS-1 细胞生长的影响

杨梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 范围内对细胞生长有明显促进作用，当提取物质量浓度高于20 μg/mL，INS-1 细胞的活性随杨梅多酚提取物浓度的增加而逐渐降低，高浓度的杨梅多酚提取物对INS-1 细胞的生长均有明显的抑制作用（图2）。因此，选定质量浓度范围为0～20 μg/mL的杨梅多酚提取物研究其对糖毒性损伤细胞活性的保护作用。

2.3 杨梅多酚提取物对高糖损伤INS-1 细胞活力的影响

如图3所示，高糖损伤模型组细胞活性下降69.333%，在试验的质量浓度范围内（0.5～20 μg/mL），杨梅多酚提取物对HG 诱导损伤的INS-1 细胞均有保护作用，以质量浓度5 μg/mL 的保护效

图2 杨梅多酚提取物对细胞活性的影响Fig.2 The effects of Chinese bayberry polyphenol extract on the INS-1 cell viability

2.4 杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞凋亡和坏死的影响

图4及图5分别表示杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞凋亡和坏死的影响。对照组只有极少数细胞呈现亮荧光，高糖损伤组被染成亮荧光的细胞数目明显增多，不同质量浓度的杨梅多酚提取物干预组呈亮荧光的细胞数目相比HG 损伤组显著减少。表明HG 对INS-1 细胞产生毒害作用，使正常细胞发生凋亡并进一步发展到细胞坏死，在此试验的质量浓度范围内 （0.5～20 μg/mL），杨梅多酚提取物的干预对HG 损伤的INS-1细胞有显著的保护作用，以质量浓度5 μg/mL 的保护效果较好。且低、中质量浓度（0.5～5 μg/mL）杨梅多酚提取物对糖毒性诱导的INS-1 细胞凋亡及坏死的保护作用随着CBE 质量浓度的增加保护作用增强，然而在5～20 μg/mL 范围内，CBE 对细胞的保护作用没有剂量-效应关系。

2.5 杨梅多酚提取物对Pdx-1 表达水平的影响

采用Western blot 试验观察杨梅多酚提取物处理后的Pdx-1 蛋白表达水平，如图6所示，对比果较好，与损伤组相比，细胞活性上升了14.078%。且在低质量浓度范围内（0.5～5 μg/mL），杨梅多酚提取物的保护作用与质量浓度之间呈剂量-效应关系，推测杨梅多酚提取物对“糖毒性” 损伤的INS-1 细胞的保护作用与杨梅多酚提取物促进细胞增殖生长作用之间存在密切联系。HG 损伤组，在0.5～5 μg/mL 范围内，Pdx-1 蛋白表达水平随着杨梅多酚提取物作用浓度增加逐渐提高。前面的研究发现杨梅多酚提取物对HG 诱导损伤的INS-1 细胞具有显著的保护作用，Western blot 试验结果表明这种保护作用可能是通过上调Pdx-1 蛋白的表达，刺激胰岛β 细胞的增值与分化，进而增加胰岛素的分泌来实现的。

图3 杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞损伤的影响Fig.3 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell injured by HG

3 结论与讨论

图4 杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞凋亡的影响Fig.4 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell apoptosis injured by HG

图5 杨梅多酚提取物对高糖诱导INS-1 细胞坏死的影响Fig.5 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell necrocytosis injured by HG

图6 Western blot 检测Pdx-1 蛋白表达水平Fig.6 Pdx-1 protein expression levels analysis by Western blot

有研究表明糖毒性可以通过减少胰岛β 细胞的数量，抑制胰岛素基因的表达，来降低胰岛素的合成和分泌量[13]。本试验以大鼠胰岛β 细胞系INS-1 细胞作为试验对象，首先探讨了杨梅多酚提取物对胰岛细胞活性的影响，发现杨梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 质量浓度范围内，对正常胰岛细胞生长有明显的促进作用，而高质量浓度的杨梅多酚提取物（≧20 μg/mL）对INS-1 细胞的生长有明显的抑制作用。该结果与张波[11]研究结果一致，其研究发现低浓度杨梅花色苷能显著促进INS-1 胰岛细胞增殖，而高浓度则抑制细胞增殖。这是否是由于杨梅多酚化合物在INS-1 增殖过程产生有毒代谢产物还有待进一步探讨。同时，本试验还以25 mmol/L 葡萄糖损伤48 h 作为糖毒性损伤条件，模拟机体内血糖代谢紊乱导致的胰岛素抵抗环境，研究杨梅多酚提取物对糖毒性造成细胞活性下降，细胞凋亡以及细胞坏死是否具有保护作用。结果表明，高糖损伤组细胞活性下降至69.3%，在所试验的质量浓度范围内（0.5～20 μg/mL），杨梅多酚提取物对HG 诱导损伤的INS-1 细胞有保护作用，且杨梅多酚提取物在低质量浓度（0.5～5 μg/mL）范围内保护作用呈剂量-效应关系，与损伤组相比，5 μg/mL 杨梅多酚提取物对INS-1 细胞活性的保护作用最好，可达14%以上。荧光染色结果证实杨梅多酚提取物对高糖诱导的细胞凋亡和坏死具有保护作用，且在低质量浓度范围内（0.5～5 μg/mL），杨梅多酚提取物对高糖诱导的INS-1 细胞凋亡和坏死的保护作用，随质量浓度的升高而增强。同时，本研究还证实杨梅多酚提取物能显著上调Pdx-1 蛋白的表达。有研究发现黄连素可通过增加细胞Pdx-1 的表达水平，改善高糖高脂对细胞的损害作用，其可能机制为上调Pdx-1 表达水平，增强胰岛素、GLUT-2 基因的转录活性，改善胰岛细胞功能[14]。据报道，红薯叶黄酮能改善四氧嘧啶糖尿病小鼠胰腺Pdx-1的表达水平，增强胰岛β 细胞的分泌胰岛素能力，降低血糖[15]。也有文献报道，胰岛β 细胞数量的增多有利于增加胰岛素分泌量，从而改善糖尿病的糖代谢异常[16]。结合本试验研究结果，推测杨梅多酚化合物对HG 诱导的INS-1 细胞的保护作用可能通过上调Pdx-1 表达水平，刺激胰岛β 细胞的增值与分化，增强胰岛素分泌能力而实现。