正天丸对偏头痛模型大鼠三叉神经颈髓复合体c-f os、细胞外调节蛋白激酶表达的影响※

李 慧,白方会,伍志勇,吴艳华,陈宝田

(1.广州市红十字会医院/暨南大学医学院附属广州红十字会医院,广东 广州510220;2.河南省南阳市中心医院,河南 南阳473003;3.南方医科大学南方医院,广东 广州510515)

偏头痛是一种常见的原发性头痛,表现为反复发作、单侧或双侧,中重度搏动样头痛。流行病学资料显示[1],我国偏头痛的发病率为9.3%。2016年全球疾病负担调查显示偏头痛致残性在中国排第5位[2]。其发病机制尚未明确,但大量研究表明三叉神经血管系统的激活具有重要意义[3]。三叉神经颈髓复合体(TCC)是三叉神经二级神经元,当偏头痛发作时TCC兴奋性增高,进一步向中枢传递疼痛信号,最终导致偏头痛。即刻早期基因c-f os是神经元激活的标志物,细胞外调节蛋白激酶(ERK)参与多种神经可塑性变化如痛觉的产生和维持,两者在偏头痛的发生中发挥了重要作用[4]。

《素问·痹论》说：“痛者寒气多也,有寒故痛也。”辛温药能散能行,能祛风寒通气血,通则不痛,故可止痛。正天丸是临床治疗偏头痛的主要中成药,其组成药物多为辛温之性。大量临床研究和实验研究表明,正天丸对偏头痛止痛疗效确切[5-7]。本研究拟通过观察正天丸对硝酸甘油(NTG)诱发偏头痛模型大鼠三叉神经颈髓复合体即刻早期基因c-f os、ERK表达的影响,以进一步探讨正天丸对偏头痛疼痛的防治机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠30只,体质量(280±20)g,由南方医科大学实验动物中心提供。动物饲养于清洁级动物房,12 h节律,室内温度22～26℃,湿度40%～60%,自由摄取充足的水和饲料,实验前适应性喂养7 d。实验过程中对动物的处置遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 试剂及仪器 硝酸甘油注射液(北京益民药业有限公司,国药准字H11020289);正天丸(华润三九医药股份有限公司,国药准字Z44020711);10%水合氯醛(上海五联化工厂);4%多聚甲醛溶液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);c-f os兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology);免疫荧光二抗-抗兔Cy3(南京凯基生物科技发展有限公司);p-ERK(Santa Cruz Biotechnology);β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);BCA试剂盒和ECL发光液购于碧云天试剂有限公司;Sy BrI荧光定量试剂盒、MX3005P荧光定量PCR仪(Stratagene公司);IS 2000 MM图像工作站(Kodak)。

1.3 造模与分组 按照随机数字表法将SD大鼠随机分为3组,每组10只,分别为空白组、模型组、治疗组。治疗组给予正天丸灌胃,剂量为1.62 g/(kg·d),按照成人常规口服量根据体表面积计算法换算;空白组和模型组大鼠给予相同剂量生理盐水灌胃。各组大鼠连续给药7 d。模型组、治疗组大鼠末次灌胃30 min后通过左肩皮下注射硝酸甘油注射液(10 mg/kg)制备偏头痛大鼠模型,空白组大鼠左肩部皮下注射相同剂量生理盐水。造模4 h后取材。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 行为学观察 偏头痛大鼠造模成功表现为：耳朵发红、前肢持续挠头、频繁爬笼、烦躁不安等。记录指标：①记录模型组和治疗组大鼠造模后耳红出现和消失时间;②将连续挠头5次以上定义为持续挠头,记录模型组和治疗组大鼠造模后持续挠头出现和消失时间;③记录每30 min大鼠爬笼次数,连续记录3 h。

1.4.2 标本采集与指标检测

(1)免疫荧光 各组大鼠造模4 h后,每组分别取5只行10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露心脏,剪开右心耳,4℃生理盐水快速灌注至流出液清亮,4%多聚甲醛灌注固定。断头取延髓至上颈段脊髓(至第2颈椎),4%多聚甲醛固定,蔗糖脱水。石蜡包埋切片,片厚10μm。切片进行脱蜡和水化、热抗原修复、灭火内源性过氧化物酶、封闭液封闭,加入一抗c-f os兔单克隆抗体(1∶200,#2250),过夜。滴加荧光二抗抗兔Cy3(Cat：KGIF010 1∶500),避光孵育1 h,PBS漂洗,加抗淬灭剂,中性树胶封片,倒置荧光显微镜下观察结果,红色高亮为标记的c-f os。

(2)蛋白质印迹法(Wester n blotting) 造模4 h后,冰上取延髓至上颈段脊髓(至第2颈椎),-80℃液氮保存。将组织加液氮研磨后,加入150μL RIPA裂解液及1.5μL PMSF冰上孵育30 min,1 500 r p m 4℃离心15 min,取上清液,BCA法测定蛋白浓度。每个样本各取50μg进行SDS-PAGE电泳,转PDVF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,TBST冲洗3次,加入一抗(1∶1 000),孵育过夜,HRP偶联的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀释)室温孵育l h,TBST冲洗3次,ECL化学发光法在IS 2000 MM成像系统(Kodak)进行曝光拍照,Molecular Imaging Soft ware Version 4.0(Kodak)软件分析条带灰度值,以β-actin作为内参。实验重复3次,计算均值及标准差。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差±s)表示。方差齐时采用单向方差分析或t检验进行组间比较,方差不齐时采用Welch近似方差分析法进行组间比较;整体组间比较有差异时,进一步采用Bonferroni法(方差齐时用)或Dunnett′s T3法(方差不齐用)进行各组均数的多重比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学表现 空白组大鼠未出现耳朵发红,无连续挠头,偶有爬笼;模型组和治疗组大鼠在造模后均出现双耳发红、持续挠头及频繁爬笼现象,提示造模成功。两组耳红出现和挠头开始时间比较均无明显差异,但治疗组耳红消失时间和挠头结束时间均较模型组提前,持续时间较短。治疗组在30 min后各时间段爬笼次数较模型组显著降低。见表1、表2。

表1 两组偏头痛模型大鼠耳红及持续挠头时间比较(min,¯±s)

表1 两组偏头痛模型大鼠耳红及持续挠头时间比较(min,¯±s)

注：与模型组比较,△P＜0.01

组别 耳红出现时间 耳红消失时间 挠头开始时间 挠头结束时间治疗组 3.96±0.17 102.79±2.38△ 4.01±0.19 102.43±2.39△模型组 3.88±0.27 132.55±3.78 3.86±0.21 134.41±11.74

表2 两组偏头痛模型大鼠各时间段爬笼次数比较(次±s)

表2 两组偏头痛模型大鼠各时间段爬笼次数比较(次±s)

注：与模型组同时间比较,△P＜0.01;与空白组同时间比较,▲P＜0.01

180 min治疗组28.00±1.56▲ 18.10±1.52△▲11.9±1.37△▲ 9.10±1.37△▲ 3.90±0.74△▲ 2.20±0.63△组别 0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～空白组 1.80±0.20 1.90±0.73 2.10±0.57 0.19±0.74 2.10±0.74 2.10±0.57模型组28.90±1.60▲ 23.10±2.02▲ 18.00±1.05▲ 12.90±1.79▲ 8.40±0.97▲ 4.20±1.48▲

2.2 免疫荧光结果 空白组、模型组和治疗组大鼠三叉神经颈髓复合体内均有c-fos阳性表达(图中红色荧光颗粒),空白组表达量较少,模型组c-fos蛋白呈明显高表达状态,治疗组表达亮度较模型组降低。见图1(本期第109页)。

2.3 Wester n bl otting结果 结果显示p-ERK/ERK的比值分别为：空白组(0.67±0.01),模型组(0.97±0.03),治疗组(0.77±0.00)。方差齐性检验结果显示F=4.668,P=0.036,方差不齐,采用 Welch近似方差分析法进行组间比较,整体组间比较有差异(P＜0.01),进一步采用Dunnett′s T3法进行各组均数的多重比较,结果显示模型组p-ERK/ERK较空白组明显增加(F=82.666,P=0.004),治疗组p-ERK/ERK受体蛋白表达较模型组明显降低(F=82.666,P=0.006)。见图2、图3(本期第109页)。

3 讨论

偏头痛是西医病名,归属于中医“头痛”“偏头风”范畴。传统医学对头痛的病名、病因病机和治则描述可追溯至《黄帝内经》。《素问·五脏生成》曰“是以头痛颠疾,下虚上实”。四气五味是中医基本药性理论,“辛”作为五味之一,能散、能行,有发散、行气、行血等作用。“温”作为4种药性之一,能散寒助阳。正天丸是全国名老中医陈宝田教授在经方的基础上结合自己多年的临床经验化裁得到,其大多数药物为辛温之药。正天丸以川芎为君药,味辛,性温,具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛之功效。方中配麻黄、细辛、附子,能加强川芎活血行气、祛风止痛之力。钩藤息风定惊;白芍柔肝止痛;羌活祛湿止痛;独活通痹止痛,用于少阴伏风头痛;防风味辛,性温,胜湿止痛,以上为臣药,能加强川芎祛风散寒止痛之力。地黄养阴生津,当归活血止痛,鸡血藤活血通络,桃仁活血化瘀,红花散瘀止痛,皆为佐药,以助川芎活血化瘀止痛。白芷祛风止痛,是正天丸中的佐使药。作为治疗偏头痛的首选中成药,正天丸的临床疗效得到广大医者和患者的好评[6-7],但其作用机制尚未明确。

近年来,越来越多的临床和实验研究表明,ERK在神经的可塑性变化如痛觉等的产生中发挥了重要作用[8]。磷酸化的ERK也是神经元被伤害性信息激活的标志物。实验研究表明,ERK参与神经疼痛形成的可能机制是：慢性损伤促使p-ERK细胞核核内转移,使其下游信号CREB磷酸化,改变目的基因c-f os的表达[9]。在通过大鼠皮下注射福尔马林导致的急性疼痛模型中,三叉神经脊束核存在客观数量p-ERK的表达,说明了ERK是三叉神经脊束核传导伤害性刺激的介质[10]。在硝酸甘油导致的偏头痛大鼠模型中,活化的肥大细胞诱发了延迟性痛觉过敏[11],同时可以导致p-ERK在三叉神经脊束核表达增加,也和偏头痛发作时的神经源性炎症反应和中枢性致敏反应相关[12]。本研究结果显示：模型组大鼠TCC中p-ERK的表达较正常空白组明显增加,说明给予NTG皮下注射后,激活了TCC的ERK信号通路,再次验证了ERK的磷酸化参与了偏头痛发作过程中的痛觉信息传递。治疗组的p-ERK表达较模型组降低,表明抑制ERK信号的活化也可能是正天丸治疗偏头痛的作用机制之一。

c-f os既是ERK信号通路的下游因子,也是伤害性信息激活神经元的标志物[13]。在本研究中,硝酸甘油偏头痛模型大鼠的三叉神经颈髓复合体呈明显高表达状态,对c-f os蛋白水平的检测间接的反映出三叉神经感觉神经元的激活状态。本研究的结果显示硝酸甘油皮下注射4 h后,c-fos在偏头痛大鼠三叉神经颈髓复合体内呈明显阳性表达,表明三叉神经感觉神经元成功激活。有文献报道应用硝酸甘油4 h后,三叉神经脊束核尾侧部,中脑导水管周围灰质、视上核、室旁核等感受痛觉信息的相关脑区均可见c-fos的明显阳性表达[14],更进一步支持了我们结果的可靠性。正天丸可以抑制三叉神经血管系统感觉神经元的激活。

综上所述,三叉神经颈髓复合体中ERK表达上调参与了偏头痛的发作,辛温止痛法正天丸可以通过降低偏头痛模型大鼠三叉神经颈髓复合体内c-f os、ERK的过表达,达到减轻偏头痛疼痛的作用,为其临床疗效提供了有力的理论依据。但偏头痛的发病机制涉及面广,正天丸对其他神经递质的影响有待进一步研究。