亲环蛋白D在癫痫大鼠模型海马组织中的表达及意义

卢理英 彭潇 张旭

癫痫是临床常见的神经功能异常疾病[1-2]，发病机制十分复杂，目前仍无有效治疗手段。近年来，学者发现线粒体功能异常与癫痫发病密切相关[3]。亲环蛋白D（CypD）是构成线粒体通透性转变孔的关键调节元件之一；在氧自由基或者Ca2+刺激下，通透性转变孔持续开放，导致线粒体肿胀、细胞色素C（Cyt-C）释放，引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的级联活化，最终由Caspase-3启动凋亡[4-5]。本研究通过氯化锂-匹罗卡品腹腔注射方法构建大鼠癫痫模型，检测CypD在癫痫模型大鼠海马组织中的表达，探讨其意义，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 凋亡试剂盒（C1086）购于上海碧云天生物技术有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）、过氧化氢酶（CAT）（A007-2）和丙二醛（MDA）（A003-1）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，AccuPowerGreenstarTMqPCR PreMix试剂盒（K-6200）购于韩国Bioneer公司，CypD（43603）、Cyt-C（4280）、Caspase-3（9662）、β-Actin（3700）单克隆抗体购于美国 Cell Signaling Technology公司。

1.2 动物分组和处理 50只6～8周龄雄性SD大鼠[动物使用许可证号：SCXK（浙）2015-0009，体质量（200±20）g]由温州医科大实验动物中心提供。用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射40只6～8周龄的SD大鼠建立癫痫模型，最终取20只癫痫发作级别达Ⅳ级以上的大鼠纳入实验。将癫痫发作的SD大鼠按照随机数字表法分为癫痫组和CypD抑制剂环孢素A（CsA）处理组（CsA组），每组10只。另取10只SD大鼠作为对照组。CsA组腹腔注射6mg/kg CsA，癫痫组和对照组分别腹腔注射等量的0.9%氯化钠注射液。采用断头法处死各组SD大鼠，用剪刀拨开大鼠脑壳，分离脑组织，去除小脑，沿中线切开大脑，获取海马组织，进行后续实验。

1.3 癫痫模型的构建 40只SD大鼠腹腔内注射127mg/kg氯化锂18h后，注射硫酸阿托品（1mg/kg）降低毒副反应，再腹腔注射30mg/kg匹罗卡品，若首次注射匹罗卡品30min后，未出现癫痫症状者，可重复腹腔注射30mg/kg匹罗卡品，总数不超过3次。按Racine评分[6]评价每只大鼠癫痫发作等级，癫痫发作90min后给予地西泮（10mg/kg）终止。

1.4 CypD mRNA的相对表达量 检测采用PCR法。取3组大鼠海马组织分别加入Trizol液，提取总RNA，并合成cDNA。按照AccuPowerGreenstarTMqPCR Pre-Mix试剂盒说明书方法，配置20μl的总反应体系，包括：cDNA 1μl、正负链引物 0.8μl，qPCR PreMix 10μl，0.9%氯化钠注射液7.4μl，在适当条件下，进行PCR后，使用2-ΔΔCT法分析CypD mRNA表达情况。CypD引物序列：（正义链：ACACCAATGGCTCTCAGTTC，负义链：AGTGGCCTTCCTCATACTCA），GAPDH 引物序列：（正义链：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，负义链：GAAGATGGTGATGGGATTTC）。

1.5 CypD、Caspase-3、Cyt-C蛋白相对表达量 检测采用Western blot法，将海马组织制成匀浆后，冰上加入细胞裂解液裂解，低温离心后，吸取上清液。按Bradford蛋白浓度测定方法作蛋白定量，取20μg总蛋白8%～12%聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜，将膜置入含有5%脱脂牛奶的TBST溶液，室温下封闭1h。按一定稀释比例加入一抗，4℃过夜，用TBST洗膜8 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1～2h，再次用TBST洗膜8min×3次，增强化学发光液发光、显影和定影。用Image J软件进行定量计算各个蛋白的相对表达量。

1.6 海马组织细胞凋亡数 检测采用TUNEL染色法。取海马组织常规脱蜡处理后，滴入20μg/ml的蛋白酶K，孵育15min，磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入0.3%甲醇-过氧化氢溶液，孵育20min，再用磷酸盐缓冲液洗涤3次。按照每个样品50μl，添加TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，滴加0.5ml终止液，洗涤3次；加入0.5ml显色液进行样品显色，光镜下观察细胞凋亡，并统计每个样本单个视野下显色阳性细胞数，取3个视野，求平均值。

1.7 检测SOD、CAT和MDA含量 采用WST-1法检测SOD含量、钼酸铵法检测CAT、TBA法检测MDA含量。将海马组织用0.9%氯化钠注射液制成质量体积比为1∶9匀浆，在4℃离心机中以4 000r/min离心10min，取上清液，严格按照试剂盒说明书进行操作，采用ELISA方法检测SOD、CAT和MDA含量。

1.8 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠CypD mRNA与蛋白、Cyt-C、Caspase-3相对表达量和细胞凋亡数比较 见表1。

由表1可见，3组大鼠CypD mRNA与蛋白相对表达量，海马组织细胞凋亡数，Cyt-C、Caspase-3相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与对照组比较，癫痫组CypD mRNA与蛋白相对表达量，海马组织细胞凋亡数，Cyt-C、Caspase-3相对表达量增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与癫痫组比较，CsA组CypD mRNA与蛋白相对表达量，海马组织细胞凋亡数，Cyt-C、Caspase-3相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CsA组CypD mRNA与蛋白相对表达量，海马组织细胞凋亡数，Cyt-C、Caspase-3相对表达量与对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。3组大鼠海马组织 CypD、Cyt-C、Caspase-3 蛋白表达量电泳图见图1。

表1 3组大鼠CypD mRNA与蛋白、Cyt-C、Caspase-3相对表达量和细胞凋亡数比较

图1 3组大鼠海马组织CypD、Cyt-C、Caspase-3蛋白表达量电泳图

2.23 组大鼠海马组织SOD、CAT和MDA含量比较 见表2。

表2 3组大鼠海马组织SOD、CAT和MDA含量比较

由表2可见，3组SOD、CAT和MDA含量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与对照组比较，癫痫组SOD、CAT含量降低，MDA含量增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与癫痫组比较，CsA组SOD、CAT含量增高，MDA含量降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CsA组SOD、CAT、MDA含量与对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

CypD又称cyclophilin 40，因与CSA靶向性结合而得名，主要分布于线粒体基质中，在神经系统疾病发生与发展中扮演重要角色[4]。氧化应激条件下，CypD介导氧自由基诱导SH-SY5Y细胞损伤[7]，降低CypD表达，减轻脑缺血再灌注损伤[8]。CypD也参与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、多发性硬化等）发生过程[9-10]。近年来研究发现CypD的作用有双面性，有学者认为CypD与海马组织神经网络调节有关，CypD基因敲除小鼠的记忆和学习能力明显增强[11]。也有学者认为CypD缺陷的小鼠学习、记忆及回避行为较正常小鼠更为完善[12]。因此，明确CypD在神经系统疾病发生和发展中的作用，对寻找靶向性预防和治疗药物具有重要意义。

在钙超载或者氧化应激条件下，CypD与蛋白电压依赖性阴离子通道、腺苷酸转位子共同构成的线粒体通透性转换孔持续开放，导致线粒体膜电位下降，从而启动线粒体凋亡途径[4]。线粒体凋亡途径是癫痫诱发神经损害的重要途径之一，多种抗癫痫药物通过调节线粒体功能发挥抗癫痫、镇静作用[13-14]。本研究结果显示，在癫痫模型中，CypD表达量和mRNA水平较明显增高，提示可能发生了线粒体通透性转换孔开放、线粒体损伤。

氯化锂-匹罗卡品通过激活谷氨酸兴奋通路，诱发癫痫发作和癫痫持续状态，是研究海马区域，尤其是CA1和CA3区细胞凋亡的常用模型。本研究TUNEL染色结果亦显示癫痫组海马组织内脑细胞凋亡较对照显著增高，该结果与文献相似[15]。癫痫组Cyt-C释放量和Caspase-3表达量明显增高，提示了癫痫发病过程中，启动了线粒体凋亡途径。CSA靶向性抑制CypD后，CSA组Cyt-C释放量和Caspase-3明显下降，而细胞凋亡数量明显降低，说明了靶向性抑制CypD，可降低癫痫模型大鼠海马组织线粒体凋亡途径的启动。另外，与对照组比较，CsA组SOD、CAT含量增高，MDA含量降低，提示CsA靶向性抑制CypD后，癫痫大鼠海马组织内氧化应激水平降低，说明CypD启动线粒体凋亡途径，可能与其调节的氧化应激水平有关。

综上所述，在氯化锂-匹罗卡品诱发的癫痫模型中，海马组织CypD表达增加，启动了线粒体凋亡途径。但本研究仅以单一的CsA作为阳性对照，分析CypD在癫痫中的表达及其意义，仍需从基因水平上，甚至采用基因敲除小鼠的手段，进一步分析CypD在癫痫中作用，从而为研究预防和治疗癫痫的CypD靶向性药物提供更充分的根据。