HPLC法对斑花黄堇中普托品的含量测定

王 怡，王 敏,王志波，林鹏程,3*

(1.青海民族大药学院，青海西宁810007;2.青海省药物分析重点实验室，青海西宁810007;3.青藏高原植物化学重点实验室，青海西宁810007)

斑花黄堇（Corydalis conspersa Maxim）为罂粟科紫堇属多年生草本植物，是生长在海拔4 300 m以上高寒流石滩中的青藏高原特色药用植物[1]，全草用于治疗瘟疫、烧伤、赤巴病(热证)等，是重要的寒性藏药药材[2-3]。现代药理研究发现它具有镇痛、抗炎、抗焦虑、保肝、杀虫、抗肿瘤等活性[4-6]。普托品类生物碱主要存在于罂粟科、小檗科、马兜铃科等植物中。普托品可改善学习记忆能力，并可抑制AChE的活性。普托品的功效是活血通络止痛，用于治疗高血压、坐骨神经痛等疾病[7]，同时对于心血管疾病也有一定的作用[8]。目前国内外的文献中未见斑花黄堇中普托品含量的报道。本研究采用高效液相法建立藏药斑花黄堇中普托品含量的测定方法，为深入研究斑花黄堇生物碱成分奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

仪器：Agilent 1100 series液相色谱仪（美国Agilent公司）；十万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；KH-300DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

普托品对照品（上海宝曼生物科技有限公司，HPLC≥98%）；甲醇（HPLC级色谱纯，山东禹王有限公司）水为超纯水。

斑花黄堇为2016年8月采于青海互助北山，经青海民族大学林鹏程教授鉴定为罂粟科紫堇属斑花黄堇。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

对照品溶液的配制：参考文献[9]中溶液的配制方法，称取普托品标准品8 mg，用提取药材所用提取剂溶解，转移到10 mL容量瓶中，定容至刻度线。配制成浓度为0.8 mg/mL的普托品标准溶液，过0.45μm滤膜备用。

2.2 供试品品溶液制备

供试品溶液的制备：称取斑花黄堇药材粉末1.0 g，用50 mL甲醇、50 mL水、2.7 mL盐酸配制成提取剂，在斑花黄堇药材粉末中加入25 mL提取剂，超声提取1 h。移取约2 mL溶液用0.45μm滤膜过滤，取滤液备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(250 nm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1mol/L乙酸铵溶液-磷酸-氨水；检测波长：285.16 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量10μL[10]。在上述条件下，达到较好的分离，R＞1.5，供试品与标准品的色谱图见图1和图2。

图1 普托品对照品的HPLC色谱图

图2 斑花黄堇样品溶液的HPLC色谱图

2.4 线性范围的考察

由普托品的浓度和峰面积的积分值可得，普托品的浓度在0.05～0.80 mg/mL呈良好的线性关系，回归方程为：Y=12 109X+76.19,R2=0.999 7，见表1。

表1 浓度与峰面积数据记录

2.5 精密度试验

精密吸取10μL 2.2项下的供试品溶液，按2.3项下色谱条件，重复进样5次并记录峰面积，计算峰面积积分值的RSD值。结果普托品的RSD值为1.86%，符合实验要求。

2.6 稳定性试验

吸取10μL 2.2项下的供试品溶液，并按2.3项下确定的色谱条件，每隔2 h进一次样，记录峰面积，根据峰面积的变化，确定供试品溶液在12 h内的稳定性，以峰面积积分值为指标计算RSD值，考察供试品溶液的稳定性。结果普托品的峰面积RSD值为1.30%，表明供试品在12 h内稳定[11-12]。

2.7 重复性实验

称取5份斑花黄堇样品，依据2.2项下的方法制得供试品溶液，按2.3项下色谱条件，测定并记录峰面积，计算普托品含量平均值为0.20 mg/mL，RSD值为1.60%，结果符合实验要求。

2.8 加样回收率实验

吸取已知含量样品溶液5.0 mL，共9份，分为3组，分别添加相当于样品含量的80%，100%，120%的普托品对照品[13-14]，按2.3项下的色谱条件进行测定，计算平均回收率为103.42%，RSD值为2.20%。表明分析误差和操作过程中的损失少，该实验方法可靠。

2.9 斑花黄堇中普托品含量测定

吸取配制好的普托品对照品溶液5 mL于另外的10 mL容量瓶中，再用提取剂定容至刻度线，贴好标签注明浓度，依次稀释，最后得到一系列浓度梯度(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/mL)。按2.3项下确定的色谱条件测定斑花黄堇中普托品的峰面积，按标准曲线法[15-16]，计算普托品在斑花黄堇中的含量。结果表明普托品的含量为0.19 mg/mL。

3 讨论

本实验采用高效液相色谱法测定藏药材斑花黄堇中普托品含量，利用高效液相色谱分离良好、定量准确等优点，在实验过程中，我们探究了多种流动相对谱图峰型的影响，最后得出甲醇-0.1mol/L乙酸铵溶液-磷酸-氨水作为流动相峰型良好，基线平稳。在此流动相下得到标准品色谱图的出峰时间为14.2 min，在相同的色谱条件下得到样品的色谱图在14.2 min时有与标准品相对应的峰。证明在斑花黄堇中含有生物碱普托品，由峰面积的积分值，采用外标法测定的藏药材斑花黄堇中普托品的含量为0.19 mg/mL，本实验的目的已经达到，得出所需结果，为之后研究藏药材斑花黄堇的生物活性奠定了基础。