HCMV IE86对恶性胶质瘤细胞凋亡及p53表达活性的影响

刘 婷， 钱冬萌， 胡 明， 于 淼， 张现娟， 秦子英， 刘小可， 王 斌

(青岛大学医学院 病原生物学教研室，山东 青岛 266071)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)为线性双链DNA病毒，属于β疱疹病毒亚科[1]。HCMV感染相当普遍，我国普通人群感染率为80%以上，某些特殊地区或人群中可达100%[2]。IE86基因修饰小鼠模型是利用DNA原核显微注射方法，将IE86基因整合到小鼠其中一条染色体上，从而得到半合子首代(F0)转基因小鼠，其后代只有一部分个体带有整合的基因。理论上，F1代小鼠中有50%为转基因杂合子小鼠，50%为野生型小鼠，需要进行筛选鉴定。在制作同一批转基因小鼠后，将其中的一部分与正常的野生型小鼠杂交，再通过同一窝的阳性雌雄小鼠交配，在基因同源重组作用下，最终得到纯合子小鼠。IE86是一种重要的反式激活因子，在HCMV复制中发挥关键作用，并与许多疾病的发病机制有关。先前的研究表明，IE86通过与细胞基因或蛋白直接相互作用来调节宿主细胞中的宿主基因表达并且影响细胞的增殖与凋亡[3]。研究发现，HCMV感染与恶性神经胶质瘤关系密切，其基因的表达随恶性程度增高而增高[4]。但IE86与恶性胶质瘤发生发展之间的关系尚不清楚。细胞蛋白p53为肿瘤抑制基因产物和细胞周期抑制剂[5-6]。研究表明p53蛋白可调节各种基因的转录，包括涉及细胞周期调控、DNA修复和程序性细胞死亡[7-9]。p53蛋白能活化p21蛋白，以此蛋白为中介物质，对细胞分化和增殖有抑制作用[10]。因此推测，IE86蛋白可通过p53信号通路对恶性神经胶质瘤细胞凋亡产生影响。本研究旨在利用可以持续稳定表达IE86的基因修饰小鼠模型，克服物种的特异性，建立一个有机内部环境，在体内进一步探究IE86蛋白与p53的作用关系，及其对胶质瘤细胞凋亡的影响，目的是阐明IE86蛋白在维持病毒感染中的作用，为恶性神经胶质瘤细胞凋亡相关分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与小鼠 PF级IE86基因修饰小鼠和野生小鼠各24只，雄性，6～7周龄，质量为17～20 g，获取于青岛大学病原生物学实验室；UL261细胞株购自赛齐华东细胞库。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清(FBS,Hyclone)；DMEM(Hyclone)，青链霉素混合液(Solarbio)，兔单抗p53蛋白(Proteintech)，兔单抗p21蛋白(Bioss)，兔单抗IE蛋白(Millipore)，羊抗兔二抗(Bioss)，兔抗鼠二抗(Jackson)，引物(上海生工生物有限公司，序列见表1)，Universal Genomic DNA Kit(CWBIO)，RNApure Tissue kit(CWBIO)，Super GelRed(US Everbright Inc.)；BIO RAD Real-time PCR仪(My-iQ Optics Module)，蛋白凝胶电泳系统(韦伯)，显微镜(奥林巴斯CX31)等。

表1 所用引物

1.2 方法

1.2.1 PCR鉴定基因修饰小鼠IE86表达情况 剪去2～5 mm的小鼠尾尖组织，置于1.5 mL离心管中，加入100 μL蛋白酶K于70 ℃过夜消化。提取基因组DNA,并以此DNA为模板，加入IE86引物、反应酶等进行PCR扩增DNA。反应产物用于琼脂糖凝胶电泳，观察目的DNA条带。

1.2.2 小鼠腋下接种细胞并观察生长情况 传代培养UL261细胞，选择对数生长期细胞悬液0.1 mL(约3×106个活细胞)，取IE86基因修饰小鼠和野生小鼠各12只，将细胞缓慢注入右腋下部皮肤。肿瘤移植后观察肿瘤种植部位出瘤的时间、肿瘤大小、质地等情况及变化。游标卡尺每2 d测量肿瘤的最长径(a)及最短径(b)，计算肿瘤体积，公式为 V(mm3)=a×b2×0.5。以肿瘤体积(纵坐标)对时间(横坐标)的变化绘制两组肿瘤生长曲线。终止实验时，测量终末瘤重量。

1.2.3 HE染色 取组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水且石蜡包埋，切片厚5 mm，常规脱蜡，苏木素染色8 min，自来水冲洗去浮色，1%盐酸乙醇分化5～10 s，自来水冲洗，温水返蓝2 min，伊红1 min，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.2.4 实时定量PCR 以β-actin作为内参基因，内参基因以及目的基因各设3个平行反应管。反应体系为20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，IE86、p53上下游引物分别为1 μL，2 μL cDNA，6 μL ddH2O。94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 min，55 ℃ 30 s，循环40次。在55 ℃ 30 s时读取荧光值。

1.2.5 免疫组化 取组织石蜡包埋切片，常规脱蜡，放入免疫组化抗原修复缓冲液(pH值6.0)煮沸冷却至室温，用蒸馏水和PBS洗涤10 min，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，洗涤后滴加p53(稀释浓度1∶100)、p21(稀释浓度1∶100)抗体并于37 ℃避光放置1 h，洗涤后滴加二抗(稀释浓度1∶100)于37 ℃放置30 min，洗涤后加DAB显色1 min，苏木素染色1 min，常规脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.6 TUNEL检测肿瘤组织中细胞凋亡情况 取组织石蜡包埋切片，常规脱蜡，滴加蛋白酶K，室温5 min后PBS洗涤，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，洗涤后滴加TUNEL反应液覆盖组织，37 ℃避光放置1 h。洗涤后加POD转换液，37 ℃避光放置30 min，洗涤后加DAB显色1 min，苏木素染色1 min，常规脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，所得数据以 χ±S表示。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较进行单因素方差分析，*P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 基因修饰小鼠IE86表达情况

从小鼠尾尖中提取DNA，PCR法鉴定IE86阳性和阴性小鼠。结果显示，基因修饰小鼠中IE86显著表达，野生小鼠无IE86表达，结果表明成功构建了IE86基因修饰小鼠模型(图1)。根据IE86是否表达将小鼠分为实验组和对照组。

2.2 荷胶质瘤鼠肿瘤生长情况

将UL261细胞悬液植入皮下2周后，荷瘤鼠开始出现倦怠少动以及消瘦现象。植瘤6 d时，肉眼观察荷瘤鼠腋下可见豆粒大小肿块。接种17 d时，荷瘤鼠腋下肿瘤呈近指数生长，随时间增加，肿瘤体积呈明显增大(图2A)。荷瘤鼠平均生存期为17～25 d，致瘤率为100%。解剖荷瘤鼠可见肿瘤呈椭圆形或不规则形，边界较清楚，瘤体解剖面为实性，色白且呈鱼肉状，瘤内可见出血坏死灶(图2B)。高倍镜下观察，HE染色可见肿瘤组织内瘤细胞呈圆形、椭圆形和梭形，胞核大而圆；细胞增生活跃，分裂相多见，细胞核较多(图2C)。实验终末时IE86阳性肿瘤组织的瘤体积显著高于IE86阴性组，差异有显著意义(P<0.05) (图2D)。终末瘤体的重量差异同样具有统计学意义(P<0.05) (图2E) 。

图1 PCR鉴定基因修饰小鼠模型IE86表达情况Fig.1 PCR identification of UL122 gene modified mouse model construction

M:DNA分子标记；1:阴性条带；2:阳性条带；-:水对照；+:阳性对照；PCR产物条带大小为211 bp

M:DNA molecular marker;1:negative band;2:positive band;-:water control;+:positive control；The PCR product band size was 211 bp

2.3 IE86对恶性神经胶质瘤组织中p53 mRNA表达的影响

Real-time PCR 结果显示(图3)，与IE86阴性肿瘤组织相比IE86阳性肿瘤组织p53表达量显著增高，差异有显著意义(P<0.05)；同时与IE86阴性脑组织相比IE86阳性脑组织p53表达量也显著增高，差异有显著意义(P<0.05)。IE86阳性肿瘤组织和IE86阳性脑组织中存在IE86基因表达，IE86阴性肿瘤组织和IE86阴性脑组织中不表达IE86基因。

2.4 IE86对恶性神经胶质瘤组织中p53蛋白表达的影响

取组织石蜡包埋切片进行免疫组化以检测p53蛋白表达量，结果显示(图4)，肿瘤组织中p53阳性染色明显强于正常脑组织，且与IE86阴性肿瘤组织相比IE86阳性肿瘤组织p53蛋白阳性染色明显增强，差异有显著意义(P<0.05)，与IE86阴性脑组织相比IE86阳性脑组织p53表达量也显著增高，差异有显著意义(P<0.05)，这与Real-time PCR 结果相一致。

图2 IE86基因修饰小鼠腋下荷 瘤生长情况况Fig.2 Effect of IE86 protein on the growth of tumor bearing mouseA、B:小鼠荷瘤情况(a、b分别为阴性和阳性小鼠)；C:肿瘤组织病理情况(a、b分别为阴性和阳性小鼠)；D、E:荷瘤小鼠肿瘤生长情况, *P<0.05A, B: tumor-bearing condition in mice (a, b are negative and positive mice, respectively); C: pathological condition of tumor tissue (a, b are negative and positive mice, respectively); D, E: tumor growth of tumor-bearing mice Situation, *P<0.05

图3 Real-time PCR检测IE86与 p53的mRNA表达情况Fig.3 The expression of IE86 and p53 mRNA was detected by Real-time PCR与IE86阴性组比较, *P<0.05Compared with IE86-negative group, *P<0.05

图4 免疫组化检测肿瘤组织中IE86 与p53的蛋白表达情况Fig.4 Immunohistochemistry detection of IE86 and p53 protein expression in tumor tissueA:IE86阳性肿瘤组织；B:IE86阴性肿瘤组织；C:IE86阳性脑组织；D:IE86阴性脑组织； E:p53蛋白表达水平, *P<0.05A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 positive brain tissue;C: IE86 negative tumor tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: p53 protein expression level, *P<0.05

2.5 IE86对恶性胶质瘤组织中p53转录活性的指示标志p21的影响

取组织石蜡包埋切片进行免疫组化以检测p21蛋白表达量，结果显示(图5), 肿瘤组织中p21阳性染色明显强于正常脑组织，IE86阳性组和阴性组相比p21蛋白染色明显减弱,正常脑组织中IE86阳性组和阴性组相比p21蛋白染色同样明显减弱(P<0.05)。这表明IE86可下调恶性胶质瘤组织中p53转录活性的指示标志p21。

2.6 IE86转基因鼠肿瘤组织细胞凋亡情况

TUNEL阳性细胞在光镜下细胞核棕黄色浓染，凋亡细胞多以散在分布为主。每张切片随机取 5个高倍镜视野用以计数凋亡细胞数和总细胞数,凋亡细胞数与总细胞数之比 (即凋亡指数 apoptotic index AI)取平均值。结果表明(图6)，IE86阳性肿瘤组织与IE86阴性肿瘤组织相比凋亡细胞数较少，凋亡指数较低(P<0.05)；并且与IE86阴性脑组织相比IE86阳性脑组织凋亡细胞数较少，凋亡指数较低(P<0.05)。

图5 免疫组化检测肿瘤组织中p21 表达情况Fig.5 Detection of p21 expression in tumor tissues by ImmunohistochemistryA:IE86阳性肿瘤组织；B:IE86阴性肿瘤组织；C:IE86阳性脑组织；D:IE86阴性脑组织；E:p21蛋白表达水平, *P<0.05A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 positive brain tissue; C: IE86 negative tumor tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: p21 protein expression level, *P<0.05

图6 TUNEL检测肿瘤组织中细胞凋亡情况Fig.6 TUNEL Detection of Apoptosis in Tumor Tissues

A:IE86阳性肿瘤组织；B:IE86阴性肿瘤组织；C:IE86阳性脑组织；D:IE86阴性脑组织；E:凋亡指数, *P<0.05

A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 negative tumor tissue; C: IE86 positive brain tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: apoptotic index, *P<0.05

3 讨 论

HCMV感染和恶性胶质瘤之间的关系密切，其中IE蛋白是HCMV感染后最活跃的细胞调控蛋白。有研究表明IE蛋白可反式激活多种细胞基因进而影响细胞的增殖与凋亡[11]，其中IE86是最主要的功能蛋白[12]。IE86通过调控细胞周期和凋亡相关的重要抑癌基因 p53从而影响细胞的生长和功能，为HCMV 感染后进行干预宿主细胞的重要环节。但目前对IE86与p53关系的研究尚无一致性的结论。

本研究采用IE86基因修饰小鼠模型，是利用DNA原核显微注射方法，将IE86基因整合到小鼠其中一条染色体上，从而得到半合子首代(F0)转基因小鼠。在制作同一批转基因小鼠后，将其中的一部分与正常的野生型小鼠杂交，再利用PCR筛选鉴定IE86阳性小鼠，用以后续实验。p21基因隶属于CIP/Kip家族，是位于p53基因下游的细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子，可与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)/cyclin 复合物结合并抑制其活性，这些复合物与p53介导的G1/S期阻滞关系密切[13]。p53基因可以诱导其下游基因p21的转录，从而增加p21蛋白的合成[14]。研究表明，p21与肿瘤的分化、浸润、增生和转移等有关[15]，早期研究显示HPVl6 E5可以抑制p21基因启动子的活性并下调其表达水平，p21作为调控细胞周期进程的关键蛋白，其下调最终导致细胞生长加快且呈恶性增殖[16]。然而，HCMV IE86对p53及其下游基因p21影响的研究却少见报道。

本研究发现，HCMV IE86能够诱导肿瘤细胞恶性转化且抑制肿瘤细胞凋亡。基因和蛋白检测结果显示在恶性肿瘤中p53的表达与IE86的表达存在明显正相关性。为进一步证明IE86对p53在恶性胶质瘤中转录活性的影响，利用免疫组化检测肿瘤组织中p53下游基因p21蛋白表达情况，并用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果表明，IE86可下调p53转录活性，提高恶性胶质瘤细胞抗凋亡能力。本研究建立的IE86基因修饰小鼠模型，有利于进一步探讨HCMV IE86在恶性胶质瘤发生发展中的作用。