NLRC5在固有免疫及呼吸系统疾病中的作用

甘聪 田曼

南京医科大学附属儿童医院呼吸科 210008

先天性免疫反应亦被称为固有免疫反应,是机体有效识别和抵抗外来病原侵袭的第一道防线。模式识别受体是先天免疫反应中的关键传感器,其通过对病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)的识别,引发炎性细胞产生促炎因子和趋化因子,诱导免疫细胞向感染部位募集,促发免疫炎症反应[1]。目前已知的模式识别受体包括Toll样受体家族、RIG-I样受体家族、NOD 样受体家族及C型凝集素家族[1]。

NOD样受体的主要结构域包括：N 端的易变的氨基端效应结构域、中间端的NOD 域、以及C 端的富含亮氨酸重复序列,各个结构域其功能上也各有不同。根据其N 端易变氨基端效应结构域的不同,NOD 样受体可分为3个亚家族：NLRCs,其N-末端具有半胱天冬酶激活和募集域(caspase activation and recruitment domain,CARD);NAIPs,其 N-末端具有杆状病毒抑制剂重复序列(baculovirus inhibitor repeats,BIRs);及NLRPs,其N 末端具有热蛋白结构域(pyrin domain,PYD)[2-3](图1)。

NLRC5是近年来在NLRCs家族中新发现的成员,已有研究表明NLRC5能参与机体多种免疫反应,在固有免疫系统中具有重要的调节作用[4-5],本文将着重总结近年来对NLRC5的表达、免疫作用和信号传导途径,及其在呼吸系统疾病中的作用的研究。

图1 NOD样受体家族的结构[3]

1 NLRC5的结构

NLRC5由1 866个氨基酸组成,其C 末端包含27个富含亮氨酸重复序列,是所有NOD 样受体中最长的,因此NLRC5是NOD 样受体家族中最大的蛋白成员[6]。与其他NOD 样受体类似,NLRC5 具有典型的三维特征结构：N端的CARD 结构域、中间端的NOD 结构域和C 端的LRR结构域[3]。其N 端的CARD 结构域由重复的α螺旋组成,与其他大多数NOD 样受体中的CARD 区和PYD 区很少有或没有相似性,因此被称为非典型CARD 结构域,亦被称为死亡折叠区[7]。与家族其他成员结构比对表明,NLRC5与MHC Ⅱ类反式激活剂(MHC class Ⅱtransactivator,CⅡTA)密切相关[6]。

2 NLRC5的表达

2.1 NLRC5的细胞内表达定位 与其他大多数NOD 样受体蛋白不同,NLRC5是核蛋白,但NLRC5的细胞定位显示,NLRC5在细胞质和细胞核中均有表达[6]。研究发现,CⅡTA在其N 和C 末端之间具有几个核定位信号(nuclear localization signal,NLS),参与细胞核-质转运行为,这对其调节MHC Ⅱ类基因反式激活至关重要[8]。与之类似的是,NLRC5在其CARD 和NOD 结构域之间也具有双向的NLS,NLRC5 介导的MHC Ⅰ类基因表达需要NLRC5核分布和完整的NLS,而NOD 结构域对NLRC5核转位及MHC Ⅰ类基因的反式激活至关重要[9]。用蛋白核输出抑制剂来普霉素B处理后,NLRC5主要在细胞核中表达,这表明NLRC5可在细胞质和细胞核之间穿梭[9]。

2.2 NLRC5的组织表达分布 研究证实NLRC5 在人类和小鼠的多种组织中广泛表达,尤其在骨髓、淋巴结、胸腺和脾脏等免疫组织中呈高表达水平[6]。进一步的研究发现,NLRC5主要在造血细胞及免疫细胞中高表达,包括骨髓衍生的巨噬细胞、树突状细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、B淋巴细胞等小鼠原代细胞及人THP-1细胞、Jurkat T 细胞、Raji B 细胞等[6]。此外,NLRC5在肺、小肠、结肠和子宫等在具有黏膜表面的组织中高度表达,表明NLRC5可能参与系统免疫信号传导和黏膜界面宿主防御反应[6]。

2.3 NLRC5的表达调控 NLRC5可以被各种刺激诱导表达。γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)是一种被广泛报道的可诱导NLRC5 表达的刺激物。在CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、骨髓巨噬细胞、树突状细胞及THP-1、HeLa、CaCo2、HT-29 等多种免疫和上皮细胞系中,IFN-γ能强烈诱导NLRC5转录水平,此外NLRC5 能被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、多聚(肌苷酸-胞苷酸)、β干扰素(interferonβ,IFN-β)或病毒感染诱导表达[10]。NLRC5的启动子包含2 个信号传导与转录激活因子1(signal transducers andactivators of transcription-1,STAT1)结合位点,其中一个与IFN-γ结合位点重叠,另一个与核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)结合位点重叠[11]。在Stat1-/-小鼠骨髓衍生的巨噬细胞和T 细胞中,用干扰素或可诱导干扰素产生的物质处理后,NLRC5表达显著减少,由此可见STAT1可能在NLRC5表达的调节中起重要作用[12]。此外,研究发现,用双链DNA 巨细胞病毒感染人包皮成纤维细胞后,NLRC5 m RNA 表达显着上调,继而应用JAK/STAT 途径的化学抑制剂和IFN-γ中和抗体处理细胞后,NLRC5表达上调均被消除,这表明巨细胞病毒诱导的NLRC5表达上调涉及IFN-γ的自分泌,及IFN-γ受体介导的JAK/STAT 信号途径的激活[11]。总的来说,NLRC5的表达受多种因素的调控,可能与IFN-γ及其介导的JAK/STAT 信号途径相关,但更多的调控途径有待进一步研究发现。

3 NLRC5在固有免疫反应中的作用

机体的固有免疫反应主要由树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞介导,通过PAMPs或DAMPs激发促炎信号转导途径、Ⅰ型干扰素反应和炎症小体活化,在防止炎性疾病及免疫性疾病的发生中具有重要地位[13]。现有关于NLRC5的免疫调控作用研究也多集中在上述几个方面。研究发现,NLRC5能调控NF-κB 炎性传导 通路、Ⅰ型干扰素(Type Ⅰinterferon,IFN-Ⅰ)介导的炎症反应及炎症小体激活,尤其对MHC Ⅰ类基因的表达调控具有重要作用。

3.1 NLRC5调节MHC Ⅰ类基因表达 MHC Ⅰ是一类可以与几乎所有有核细胞中内源性抗原肽结合的细胞表面受体,能被自然杀伤细胞的抑制性受体识别并抑制其细胞毒性作用[10]。此外,抗原蛋白被蛋白酶水解成的抗原肽后,能通过与MCH Ⅰ类分子结合并转移至抗原呈递细胞表面,介导MHC Ⅰ类限制性CD8+T 细胞活化,对宿主防御病原体感染和抗肿瘤免疫反应至关重要[14]。研究发现,在过表达NLRC5可以诱导各种MHC Ⅰ类家族基因及与抗原加工呈递相关的基因的表达,且NLRC5所有结构域是MHCⅠ类基因诱导所必需的[15]。已知MHC Ⅱ类基因启动子上顺式调控元件X1-box、X2-box和Y-box分别与转录调节因子X 复合物、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/转录活化因子1、核转录因子Y 蛋白复合物结合形成大分子蛋白复合物,并与CⅡTA结合形成MHC Ⅱ类增强体,从而调节MHC Ⅱ类基因表达[10,16](图2)。而MHC Ⅰ类和MHCⅡ类基因在其启动子区域都具有保守的顺式调控元件X1-box、X2-box和Y-box,且NLRC5 与CⅡTA结构上具有高度相似性,这表明NLRC5介导的MHC Ⅰ类基因反式激活机制可能与CⅡTA介导的MHC Ⅱ类基因激活机制相似[10,17](图3)。此外,NLRC5 可能影响组蛋白甲基化,表明NLRC5可能通过调节MHC Ⅰ类基因座的染色体活化状态来影响基因表达[15]。

图2 MHC Ⅱ类增强体转录调节MHC Ⅱ类基因模型[10]

3.2 NLRC5是NF-κB的负调控因子 NF-κB 转录因子家族是先天免疫应答的关键组成部分,多种模式识别受体可通过对PAMPs的识别,激活下游NF-κB 信号途径,参与固有免疫反应的促炎信号传递[18]。有研究认为,NLRC5是Toll样受体4信号的负调节因子,可以直接与NF-κB抑制激酶α和β相互作用,并阻断其磷酸化,从而抑制NF-κB活化[19]。Benko等[6]发现NLRC5 的过表达可能通过影响p65 NF-κB核转位来抑制下游NF-κB信号传导。此外,NLRC5的CARD可直接与RIG-Ⅰ样受体的CARD相互作用并抑制NF-κB的激活[19]。

3.3 NLRC5是IFN-Ⅰ的负调控因子 外来病原入侵机体后可被模式识别受体识别,进而诱导机体产生IFN-Ⅰ应答,并形成抵抗病原入侵的宿主防御反应,在固有免疫反应中发挥重要作用[20]。IFN-Ⅰ家族包含13～14 个功能性IFN-α基因、IFN-β和几种其他亚型,具有抗病毒、抗增殖和免疫调节等重要作用[21]。研究发现,NRLC5 可与RIG-Ⅰ和MDA5相互作用,有效抑制RIG-Ⅰ样受体介导的IFN-Ⅰ反应[19]。转染siRNA 介导的NLRC5沉默导致巨细胞病毒和仙台病毒感染后IFN-Ⅰ的产生分泌减少[11,22]。用LPS攻击或水疱性口炎病毒感染NLRC5 缺陷型小鼠,其血清中IFN-β含量增加[23]。进一步,在LPS刺激或水疱性口炎病毒感染后的NLRC5缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞、腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞中IFN-β的产生也显示增加,然而NLRC5缺陷型小鼠骨髓来源的树突状细胞中没有发现IFN-β增加这表明NLRC5对IFN-β的负调控作用可能存在细胞类型特异性[23]。

图3 MHC Ⅰ类增强体转录调节MHC Ⅰ类基因模型[10]

3.4 NLRC5是炎症小体的激活剂 炎症小体是一组能识别PAMPs和DAMPs的细胞内模式识别受体大分子复合物,其被认为是介导固有免疫反应的重要平台,能够调节半胱天冬酶1(caspase-1)的活化,促进IL-1β 前体和IL-18前体的切割成熟,并能激发高炎症细胞凋亡[2]。先前的研究表明NLRP1和NLRP3是炎症小体的激活剂[24]。在最近的研究中NLRC5 也被提出作为炎症小体的激活剂。在293T 细胞中,NLRC5 的过表达增加 了caspase-1 的活化,从而增加IL-1β的产生和释放[10]。此外,体外研究发现,在人类骨髓THP-1细胞和原代单核细胞中NLRC5基因表达沉默后,大肠杆菌感染导致的caspase-1 活化和IL-1β成熟、分泌减少[4]。

4 NLRC5与呼吸系统疾病

对病原体的识别和炎症反应的激活是呼吸系统疾病中免疫反应的重要组成部分。NLRC5作为NLRs的一员,能调控MHC Ⅰ分子表达、激活NF-κB 信号通路,诱发炎症因子产生,与呼吸道病毒感染、支气管哮喘、急性肺损伤、肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展密切相关。

4.1 NLRC5与流行性感冒 Ranjan等[25]研究发现,在人肺上皮A549细胞系和正常人支气管上皮细胞中NLRC5的过表达可抑制流感病毒复制,并能诱导IFN-β表达增强,其进一步的区域作用研究表明,NLRC5 通过其N-末端死亡结构域与RIG-Ⅰ相互作用以增强抗流感病毒感染的免疫应答。Lupfer等[26]研究发现,NLRC5 基因敲除小鼠在甲型流感病毒感染之前即表现出MHCⅠ表达减少及CD8+T细胞数量减少,在甲型流感病毒感染的情况下,NLRC5基因敲除小鼠出现CD8+T 细胞功能降低和病毒清除受损。这表明,NLRC5对于促进流感病毒感染期间的宿主防御具有重要作用。

4.2 NLRC5 与支气管哮喘(哮喘) Guo 等[27]研究发现,RSV 感染后,A549气道上皮细胞中RIG-Ⅰ表达上调,导致干扰素调节因子3活化和IFN-β分泌,并反过来诱导A549细胞中的NLRC5 表达,从而上调MHCⅠ表达,促进细胞毒性T 细胞活化和抗病毒免疫,这可能与婴幼儿RSV 感染致细支气管炎,并诱发成年后持续性喘息和过敏性哮喘有关。国内也有研究发现,RSV 感染可过诱导干扰素释放和病毒双链RNA 显著上调NLRC5的表达,且抑制NLRC5的表达后能降低RSV 感染上调的MHCⅠ表达,这可能是RSV 所致免疫病理损伤及诱发哮喘的潜在原因[28]。Triantafilou等[29]发现,鼻病毒通过其离子通道2B 蛋白触发支气管细胞NLRP3和NLRC5炎性体激活,并诱导IL-1β的分泌增加,从而可能诱发哮喘的急性发作。

4.3 NLRC5与急性肺损伤 早前国内已有文献报道,在腹腔注射LPS建立的小鼠急性肺损伤模型中,NLRC5 的表达显著上调,这表明NLRC5可能参与急性肺损伤的发病[30]。近期,国内也有学者发现,在气管滴注LPS诱导建立小鼠急性肺损伤模型中,小鼠肺组织和肺泡巨噬细胞中NLRC5的表达明显增高,在体外LPS诱导刺激的肺泡巨噬细胞中过表达NLRC5 时,肿瘤坏死因子α、IL-1β 和IL-6的表达下降,NF-κB 和p38 MAPK 信号通路也受到抑制,而沉默NLRC5后肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-6的表达上升,NF-κB 和p38MAPK 信号通路磷酸化上调,这些结果提示NLRC5 能够负调控肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-6的的表达,其机制可能与NLRC5负调控NF-κB 和p38 MAPK 信号通路密切相关[31]。

4.4 NLRC5与其他呼吸系统疾病 国内研究发现,在博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型中,大鼠肺组织中NLRC5的表达增加,且其表达量随时间的延长逐渐增加,提示NLRC5可能参与肺纤维化形成的整个过程[32]。此外,在非小细胞肺癌患者中,NLRC5的表达与MHC Ⅰ类的表达相关,且核NLRC5阳性和MHC Ⅰ类阳性的Ⅲ期非小细胞肺癌患者总生存期发生率较低,这提示NLRC5和MHC Ⅰ类可能是Ⅲ期非小细胞肺癌患者的阴性预后指标[33]。

5 总结与展望

NLRC5作为NOD 样受体家族最大成员,通过模式识别参与机体先天性免疫反应。已有多项研究表明,NLRC5能特异性调节MHC Ⅰ类基因表达、参与MHC Ⅰ类抗原呈递的相关基因的转录,并调节CD8+T 细胞活化以抵抗细胞内病原感染的宿主防御。NLRC5 可能抑制NF-κB 的活化并负调控IFN-Ⅰ产生。此外,NLRC5 可能作为激活剂促进炎症小体的活化。

近年来,国内外已有文献总结NLRC5 在固有免疫中的重要作用,但缺乏NLRC5 与相关系统疾病的总结。鉴于MHC Ⅰ类抗原提呈、NF-κB 信号通路的激活和炎症小体的活化同样是呼吸系统疾病中免疫反应的重要组成部分,近年来不断的研究表明,NLRC5 与呼吸道病毒感染性疾病、哮喘、急性肺损伤、肺纤维化、肺癌的发病密切相关。免疫炎症长期以来一直是呼吸系统疾病的研究热点,NLRC5的发现和研究不仅拓展了呼吸系统免疫研究领域,也给此类疾病的发病机制与治疗带来了新视角。通过靶向改变NLRC5的表达,我们可以干扰MHC Ⅰ表达、NF-κB信号通路和炎症小体的活化,进而减轻炎症反应。此外NLRC5在肺纤维化和肺癌中还具有成为潜在的诊断和预后指标可能。因此,在呼吸系统方面,NLRC5的未来研究价值是巨大的。但目前关于NLRC5在呼吸系统疾病中的作用研究多集中在细胞和动物研究,仍缺乏足够的临床研究,且关于NLRC5在免疫信号调控途径方面的作用尚不完全清楚,NLRC5的作用和应用还有待进一步探索和拓展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突