MeJA对低温胁迫下冬小麦抗寒生理及关键基因表达量的影响

赵 虎，樊晓培，罗力力，张 瑞，苍 晶，徐庆华，于 晶，张 达

(东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

低温限制着全世界农作物的分布及产量。植物对低温的应答是一个涉及多基因、多信号途径的复杂过程，植物激素脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等参与这个过程，并发挥重要作用[1]。JA及其衍生物茉莉酸甲酯(MeJA)是主要的茉莉酸类物质，可作为信号分子，参与植物响应生物及非生物胁迫。

有研究表明，外施MeJA可以显著提高低温胁迫下小麦幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性，增加可溶性蛋白的含量，降低相对电导率和丙二醛(MDA)含量，从而维持细胞膜的完整性，增强小麦抵抗低温的能力[2]。低温胁迫增加了小麦[3]、水稻[4]和拟南芥[5]体内JA的水平，促进了拟南芥、水稻JA生物合成基因的表达[4-5]，抑制了水稻JA分解代谢相关酶基因的表达[4]。JA信号途径包括信号产生、转导及下游基因表达[6]，COI1/JAZ/MYC2是JA信号转导的核心模块。COI1(Coronatine insensitive 1，冠菌素不敏感因子1)是JA信号转导途径的受体。JAZ蛋白(Jasmonate ZIM-domain，茉莉酸ZIM结构域)是转录抑制因子，可与MYC2结合抑制JA早期响应基因的表达。MYC2(Myelocytomatosis protein 2，髓细胞组织增生蛋白2)是JA信号途径的转录激活因子，在其信号转导中起重要作用[7-8]。 PDF1.2(Plant defensin 1.2，植物防卫素)基因编码一种植物防卫蛋白，研究JA不敏感型和缺陷型突变体发现，拟南芥中AtPDF1.2、AtVSP2(Vegetative storage proteins 2)基因的表达受JAs的诱导及JA信号转导途径的调控。

东农冬麦1号是首例能在东北寒冷地区安全越冬的小麦栽培品种，可耐受-30 ℃低温，返青率高于85%，其强抗寒性得到公认。本课题组前期用东农冬麦1号分蘖节构建了三个低温胁迫(5 ℃、-10 ℃和-25 ℃)相关的miRNA库[9]，应用生物信息学软件对其靶基因进行了GO富集分析和KEGG通路分析[10-11]，发现植物激素信号转导途径中 JA代谢的关键基因发生了表达变化。然而，JA是否调控冬小麦低温胁迫下的抗寒响应以及JA信号转导途径中的COI1、MYC2在冬小麦抗寒应答中所起的作用尚不明确，故本研究以东农冬麦1号为材料，探讨外源MeJA处理、大田自然降温条件下，冬小麦越冬期在低温胁迫下抗寒生理的变化，并在最佳浓度处理下，研究TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因表达量的变化，以期为揭示JA信号途径关键基因在冬小麦响应抗寒中的作用机制、激素JA调控冬小麦抗寒分子机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料为冬小麦(TriticumaestivumL.)品种东农冬麦1号，由东北农业大学农学院小麦室提供。试验于2016-2017年在东北农业大学校内试验田进行。2016年9月13日播种，完全区组设计，小区面积5 m2(2.5 m×2 m)，每个小区种植12行，行距15 cm。每行播种150粒，播深4～5 cm，常规管理。在小麦三叶期(2016年10月1日)分别对叶片喷施浓度为0.5、1.0和2.0 mmol·L-1的MeJA和蒸馏水(含0.02%的酒精)。大田自然降温且最低气温连续10日为5 ℃(2016年10月8日)、0 ℃(2016年10月25日)、-10 ℃(2016年11月9日)、-25 ℃(2017年1月11日)时分别取叶片及分蘖节(地下部分主根以上约1～2 cm左右的白色分蘖密集部位，并避免留取绿色部位)，迅速洗净吸干，剪成1 cm左右大小并分别装袋，用液氮迅速冷冻后，置于-80 ℃的超低温冷冻储存箱中保存备用。

1.2 生理指标的测定[12]

低温伤害程度的测定采用外渗电导法，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量测定采用茚三酮显色法，可溶性糖含量测定采用蒽酮法，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，SOD活性测定采用NBT法，POD活性测定采用愈创木酚法，CAT活性测定采用紫外吸收法。设置3次生物学重复。

1.3 基因表达分析

基因表达分析采用RT-qPCR 法。根据已得到的TaPDF1.2、TaCOI1和TaMYC2基因(GenBank登录号分别为NM_123809.4、HM447645.1 和KM382421.1)序列设计实时定量PCR引物，TaPDF1.2基因的正向引物和反向引物分别为5′-CCTTATCTTCGCTGCTCTTGTTC-3′和5′-CT TCTGTGCTTCCACCATTGC-3′，TaCOI1基因的正向引物和反向引物分别为5′-TTGCGGT GAGGAATGTGATTG-3′和5′-TACGGCTAT GGCTGTTAGGC-3′。TaMYC2基因的正向引物和反向引物分别为5′-GATACCCGGGGAACTTG AGCTAG-3′和5′-TCTTCCCGCCGACTTCAT GA-3′。

依次进行总RNA的提取(Trizol法)及基因组DNA的去除、反转录，并以反转录形成的cDNA为模板进行RT-qPCR检测。在Mx-3000p Real-Time PCR System(Stratagene，美国)上按照SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)说明书进行RT-qPCR。以小麦TaActin为内参基因，其扩增引物序列为5′-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3′和5′-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3′。采取2-△△Ct法计算待测基因的相对表达量。

1.4 试验数据统计分析

用Microsoft Office 2016 Excel作图，用SPSS 22软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 MeJA对低温胁迫下东农冬麦1号抗寒生理的影响

2.1.1 对低温伤害程度的影响

由表1可知，随着温度的降低，处理组与对照组冬小麦叶片和分蘖节的相对电导率均逐渐增大，-25 ℃达到最大值。分蘖节的相对电导率均小于叶片，表明分蘖节的受伤害程度小于叶片，这与分蘖节作为冬小麦主要的越冬器官有关。

5 ℃下，叶片中MeJA各浓度处理组与对照组的相对电导率差异均不显著，可能是因为MeJA在该温度下尚未发挥作用；0 ℃、-10 ℃和-25 ℃下，与对照相比，1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著降低了叶片的相对电导率，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。5 ℃和0 ℃下，分蘖节中MeJA各浓度处理组与对照组的相对电导率差异均不显著，可能是因为MeJA在这两个温度下尚未发挥作用；-10 ℃和-25 ℃下，与对照相比，1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著降低了分蘖节中的相对电导率，0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。说明1.0 mmol·L-1的MeJA处理可以提高小麦的抗寒性。

2.1.2 对丙二醛(MDA)含量的影响

由表1可知，随着温度的降低，处理组与对照组冬小麦叶片中MDA含量均呈先下降后上升的趋势，而分蘖节中MDA的含量均呈逐渐增加的趋势，-25 ℃均达到最大值。分蘖节的MDA含量低于叶片，表明分蘖节的膜脂过氧化程度小于叶片、抗寒性强于叶片。

5 ℃下，叶片中0.5和1.0 mmol·L-1MeJA处理组与对照组的MDA含量差异不显著，2.0 mmol·L-1MeJA处理的MDA含量显著高于对照，分蘖节中MeJA各浓度处理组与对照组的MDA含量差异均不显著，说明该温度尚未构成对东农冬麦1号的胁迫，尚未引起JA信号分子对低温胁迫的响应，此时，高浓度的MeJA处理对小麦叶片反倒有伤害。0 ℃、-10 ℃和-25 ℃下，与对照相比，0.5和1.0 mmol·L-1MeJA处理显著降低了叶片中的MDA含量，1.0和2.0 mmol·L-1MeJA处理显著降低了分蘖节中的MDA含量。表明1.0 mmol·L-1外源MeJA处理可以提高冬小麦的抗寒性。

2.1.3 对脯氨酸含量的影响

从表1可知，随着温度的降低，处理组与对照组冬小麦叶片及分蘖节中脯氨酸的含量均呈先升高后降低的趋势，-10 ℃达到最大值。分蘖节的脯氨酸含量大于叶片。与对照组相比，1.0 mmol·L-1MeJA处理均显著提高了小麦叶片及分蘖节的脯氨酸含量，0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。说明浓度适宜的外源MeJA可能会通过提高脯氨酸的含量来增加细胞的保水力，从而提高其抗寒性。

2.1.4 对可溶性蛋白及可溶性糖含量的影响

从表1可知，随着温度的降低，处理组与对照组叶片及分蘖节中可溶性蛋白及可溶性糖含量均呈先增加后降低的趋势，最大值均出现在-10 ℃。分蘖节的可溶性蛋白及可溶性糖含量均高于叶片。与对照组相比，1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著提高了冬小麦叶片和分蘖节中可溶性蛋白及可溶性糖的含量，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。说明浓度适宜的外源MeJA可以通过提高可溶性蛋白及可溶性糖的积累来提高小麦的渗透调节能力，从而提高其抗寒性。

表1 MeJA对低温胁迫下东农冬麦1号抗寒生理的影响Table 1 Effect of MeJA on cold resistance physiology of Dongnong Dongmai 1 under low temperature stress

同一温度、同一指标的数据后字母不同代表不同浓度的MeJA处理间差异显著(P<0.05)。下表同。

Different letters within the same temperature and the same indicator data represent significant differences between different concentrations of MeJA(P<0.05) . The same in table 2 and table 3.

2.2 MeJA对低温胁迫下东农冬麦1号抗氧化酶活性的影响

由表2可知，随着温度的降低，处理组与对照组叶片及分蘖节的SOD活性均呈逐渐升高的趋势，且最大值均出现在-25 ℃。分蘖节的SOD活性小于叶片，这可能与SOD主要存在于质体有关。与对照组相比，4种低温下1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著提高了叶片及分蘖节的SOD活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。

表2 MeJA对低温胁迫下东农冬麦1号抗氧化酶活性的影响Table 2 Effect of MeJA on antioxidant enzyme activity of Dongnong Dongmai 1 under low temperature stress

随着温度的降低，处理组与对照组叶片及分蘖节POD活性均呈先升高后降低的趋势，且最大值均出现在-10 ℃。分蘖节的POD活性大于叶片。与对照组相比，4种低温下1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著提高了叶片及分蘖节中POD的活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。

随着温度的降低，处理组与对照组叶片及分蘖节中CAT活性均呈先逐渐降低、后略有上升的趋势，最大值均出现在5 ℃。分蘖节的CAT活性小于叶片。与对照组相比，4种低温下1.0 mmol·L-1的MeJA处理均显著提高了叶片及分蘖节中CAT的活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA处理的效果在有些温度下不明显。

这些结果表明，低温胁迫下，冬小麦可以通过激活自身的抗氧化防御系统、提高抗氧化酶活性、清除ROS来提高抗寒性。

2.3 MeJA对东农冬麦1号返青率的影响

越冬后，调查了不同浓度MeJA处理下东农冬麦1号的返青率。结果表明，1.0和2.0 mmol·L-1MeJA 处理下的返青率分别为 91.5%和90.7%，显著(P<0.05)高于对照组的84.7%和0.5 mmol·L-1MeJA处理下的86.5%。

因此，结合2.1节和2.2节的结果，筛选不同低温胁迫下1.0 mmol·L-1MeJA处理的小麦叶片和分蘖节，进行JA响应基因TaPDF1.2和JA信号转导途径关键基因TaCOI1、TaMYC2的表达分析。

2.4 MeJA处理对低温胁迫下东农冬麦1号叶片和分蘖节中 TaPDF1.2、 TaCOI1、 TaMYC2表达变化的影响

从表3可知，随着温度的降低，对照组与1.0 mmol·L-1MeJA处理组叶片及分蘖节中TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因的表达量均逐渐增加，-10 ℃达到最大值，此后呈下降趋势，但-25 ℃仍高于5 ℃，整个过程表现为上调趋势。与对照组相比，不同温度下，1.0 mmol·L-1MeJA处理均显著提高了冬小麦叶片及分蘖节中TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因的表达量(P<0.05)；5 ℃下小麦叶片中TaCOI1基因表达量的变化不明显。

3 讨 论

本课题组前期的研究发现，东农冬麦1号在越冬期随着温度降低，其体内糖含量逐渐增加；外源ABA处理提高了糖代谢关键酶的活性；外源SA处理提高了东农冬麦1号蔗糖含量、蔗糖代谢相关酶的活性及基因的表达[13-14]。本研究发现，随着温度的降低，东农冬麦1号叶片和分蘖节中可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖含量逐渐增加；当温度降至-25 ℃时，上述渗透调节物质含量降低，表明极寒温度导致小麦渗透调节机制受损。外源喷施不同浓度的MeJA，均能不同程度提高东农冬麦1号叶片和分蘖节中上述渗透调节物质的积累，其中1.0 mmol·L-1MeJA处理的效果最明显。这可能与前人发现JAs诱导产生多种化学物质、细胞保护分子[15]有关。

本研究发现，在5 ℃、0 ℃时，东农冬麦1号叶片和分蘖节相对电导率较低，说明其在该低温下耐受性较好；该温度下，MeJA处理作用不明显。随着温度降至-10 ℃、-25 ℃时，叶片和分蘖节的相对电导率增大，表明其受低温胁迫程度变大；该温度下，1.0 mmol·L-1MeJA处理显著降低了其相对电导率，表明MeJA提高了膜的稳定性。这与前人的研究结果[16]相一致。随着温度的降低，东农冬麦1号叶片和分蘖节MDA含量逐渐升高，表明其膜脂过氧化程度加剧；不同浓度MeJA处理均降低了东农冬麦1号叶片和分蘖节的MDA含量，说明MeJA有助于减轻低温胁迫对东农冬麦1号膜系统的伤害。

JAs作为信号分子，可激活胁迫响应中的某些信号转导途径[17]。有研究表明，0.1 mol·L-1MeJA处理唐菖蒲叶片，可显著上调GhCOI1基因的表达；处理12 h内，GhCOI1的表达量呈现先上升后下降再上升的趋势[18]。还有研究表明，适宜浓度的MeJA处理可以促进拟南芥[19]、水稻[20]中COI1基因的相对表达。JA正调控拟南芥的抗冻性，外施JA可显著提高拟南芥冷驯化诱导的抗冻能力，这与低温处理诱导拟南芥内源JA合成相关酶的表达、提高内源JA的含量相一致。

本研究发现，1.0 mmol·L-1外源MeJA处理促进了低温胁迫下东农冬麦1号叶片及分蘖节中TaCOI1、TaMYC2、TaPDF1.2基因的表达，其表达量变化均呈先升后降趋势，这与前人的研究结果一致。其中TaPDF1.2是JA的响应基因，其表达量增加提示JA含量的增加；而TaCOI1、TaMYC2是JA信号转导途径关键基因，其表达量的增加可促进下游与抗寒相关基因的转录，进而提高植物的抗寒性。这一结果与非生物胁迫可能提高内源JA含量相吻合，也与本课题组前期转录组数据显示的低温胁迫下TaCOI1、TaMYC2基因的表达量上调相一致。这也提示我们，东农冬麦1号的强抗寒性与ABA、SA、JA等多种激素均有关，处于这些激素互作节点的基因如某些转录因子，可能在其中起到关键作用。对重要转录因子基因的功能分析将是我们下一步关注的重点。