清达颗粒对AngII诱导的高血压小鼠肾脏损害的干预研究※

● 杨美玲 周雪玲 彭美中 卢 妍 彭 军,3,4 陈友琴 Thomas Joseph SFERRA,5 褚剑锋,3,4▲

高血压是引起肾脏损害和终末期肾病的重要危险因素，其中过度激活的肾素血管紧张素系统是引起高血压及高血压肾脏损伤的重要发病机制之一[1]。现有的药物治疗措施还不能完全逆转高血压肾损害至终末期肾衰的进程，大量的基础与临床研究证实，中医药对高血压肾损害的治疗表现出了一定的潜力，但其相应作用机制尚不清楚。清达颗粒是陈可冀院士由其几十年的临床经验方清眩降压汤化裁而来的，主要药物组成有天麻、钩藤、黄芩、莲子心，具有清肝热、平肝阳等功效，主治高血压病。本文采用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)诱发的高血压小鼠为研究对象，观察在高血压肾损害进程中清达颗粒对血压、肾脏病理形态的影响，探讨该方对高血压肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物8周龄雄性C57BL/6小鼠18只，SPF级，体重20～25g，由上海斯莱克实验动物公司提供(实验动物许可证号：2018093)，在福建中医药大学实验动物中心饲养。

1.2主要实验试剂与仪器AngⅡ(Sigma，RN474-91-3，A9525-10mg)；植入式胶囊渗透压泵(ALZET)；小鼠无创血压测量系统(肯特动物无创血压测量系统，kent)；糖原PAS染色液试剂盒(Abcam)；Masson三色染色试剂盒(Abcam)；清达颗粒(由天江药业有限公司制备，批号1805351)；HE染色液(索莱宝，G1120)。

1.3动物模型构建雄性C57BL/6小鼠18只适应环境一周后常规饲养，用5%水合氯醛(7ml/kg)麻醉，依据体重编号，并由此采用数字表法，随机分为3组：(1)对照组(n=6)：剔除肩胛背部的鼠毛，作一假切口并缝合，作为对照；(2)模型组(n=6)：植入灌有AngⅡ胶囊渗透压泵，该泵可连续28d释放AngⅡ到周围组织(500ng/kg/min)，最后将其缝合。(3)给药组(n=6)：植入AngⅡ渗透压泵并灌胃给药治疗28d。给药组于手术后第一天开始予清达颗粒(生理盐水溶解，制作母液备用)灌胃给药，根据人一日一剂换算，鼠每次剂量为22.9mg/天/0.2mL，模型组和对照组灌以同等体积的生理盐水，每天1次，连续给药28d。

1.4血压测量分别测量手术前、手术第1、3、5、7、14、21天及手术第28天的收缩压和舒张压。

1.5肾脏病理检测新鲜小鼠肾脏组织去除包膜后，沿横截面将肾脏切开，取1/2肾脏组织经4%多聚甲醛固定24H后，包埋、制作石蜡切片。采用HE、PAS、Masson染色观察肾脏损伤、胶原沉积及炎症细胞在肾脏的浸润情况。HE、PAS和Masson法的染色程序参照试剂盒说明书。

1.6肾小球硬化程度评分[2]每张切片观察取6个视野，评分肾小球损伤程度。分为0分：正常肾小球、无硬化；1分：轻度损伤，肾小球损伤比例<25%；2分：中度损伤，肾小球损伤比例25%～75%；4分：完全损伤，肾小球损伤比例>75%。纤维化测量方法：每张切片取6个视野，采用IPP软件计算蓝色纤维化面积占总面积的百分比。

1.7统计学方法采用SPSS18.0软件对数据进行统计分析，计量资料若符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，若不符合则以中位数和四分位数间距(M，Q)表示，采用非参数分析(秩和检验等)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1清达颗粒对血压的影响给药前，三组的血压差异无统计学意义(P>0.05)；给药后，模型组的血压从第1天开始就逐渐升高，与对照组相比具有统计学差异；给药组的血压(收缩压从第7天开始到第28天、舒张压从第21天到第28天)与模型组相比具有统计学差异(P<0.05)，清达颗粒干预显著抑制了血压的升高幅度。见表1、表2。

表1 清达颗粒连续给药后各组小鼠不同时间点收缩压变化

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

表2 清达颗粒连续给药后各组小鼠不同时间点舒张压变化

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

2.2清达颗粒对小鼠肾脏病理特征和硬化积分的影响如图1所示，对照组可见肾小球形态正常无固缩，肾小囊未增大，肾小囊壁未见增厚，近、远曲小管结构正常，未见蛋白管型；模型组可见大多数肾小球严重固缩，灌注不足，肾小囊增大，球囊粘连，肾小囊壁增厚(→所示)；而清达颗粒组肾小球结构形态相比模型组大有改善，肾小球固缩减轻，肾小囊减小。进一步评估肾小球硬化程度，采用积分评估，如图2所示，与对照组对比，模型组肾小球硬化积分显著增高(P<0.05)，清达颗粒给药后肾小球硬化积分较模型组显著降低(P<0.05)。PAS染色显示(图3)，模型组肾小球固缩，基底膜增厚、肾小管萎缩、肾小囊增宽(→所示)，清达颗粒干预显著改善上述病理特征。

图1 清达颗粒对AngⅡ引起的肾脏损害的一般病理影响(HE染色，×400)

图2 清达颗粒对各组肾小球硬化程度积分的影响

图3 清达颗粒对AngⅡ引起的肾小球基底膜的影响(PAS染色，×400)

2.3清达颗粒对肾脏纤维化的影响如图4所示，与对照组对比模型组肾小球和肾间质蓝染明显(→所示)，清达颗粒干预后，蓝染的胶原纤维明显减少。如图5所示，与对照组比较，模型组肾小囊及肾间质胶原阳性表达明显(P<0.05)，给药组肾小囊及肾间质纤维性物质较模型组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图4 清达颗粒对AngⅡ引起的肾脏纤维化的影响(Masson染色，×400)

图5 清达颗粒对各组肾脏胶原阳性区域比率的影响

3 讨论

高血压是最常见的慢性疾病之一，在《中国高血压防治指南2018修订版》中，将高血压的诊断标准定为：在未使用降压药物的情况下，诊室收缩压≥140mm Hg和(或)舒张压≥90mm Hg；根据血压水平分为正常、正常高值血压和1、2、3级高血压；同时，还根据血压水平、心血管危险因素、靶器官损害、临床并发症和糖尿病进行心血管危险分层，分为低危、中危、高危和很高危4个层次。3级高血压伴1项及1项以上危险因素，合并靶器官损害、CKD3期以上、糖尿病等均属于心血管风险很高危患者[3]。可见，高血压具有高发病率及致死率，可累及多处靶器官。其中，肾脏损伤是高血压很常见的并发症之一。美国最新肾脏疾病统计数据显示，高血压是导致终末期肾病的第2位病因[4-5]。

AngⅡ是血管紧张素中最重要的组成部分，具有收缩血管、促进醛固酮分泌、参与渴觉反应、影响心输出量、增加血管通透性等生理功能。其中收缩血管和促进醛固酮分泌是最为重要的[6]。研究证明，Ang Ⅱ通过作用于球状带上的AI受体(受体存在于细胞膜上)，二者结合以后诱导生成一种酶蛋白，后者便以某种方式促使胆固醇转变成孕烯醇酮，然后孕烯醇酮再经多次转变，最后生成醛固酮。当醛固酮分泌过多时将引起钠水潴留进而血压升高[7]。因此，AngⅡ不仅能影响小动脉的紧张度，而且还能影响血容量，这两种因素的相互作用，在很大程度上，决定了血压的高低。肾脏器官的细胞上存在有血管紧张素受体，有研究表明，高血压肾损害的发病机制与交感神经系统(SNS)活性升高、肾素-血管紧张素系统异常、盐负荷、遗传或先天因素、高血压状态下肾小球前小动脉阻力增加及肾小球内高压有关[4]。

清达颗粒是陈可冀院士由其60余年临床经验方清眩降压汤[8]化裁而来，主要用于治疗高血压病患者。其中天麻、钩藤平肝潜阳熄风，辅以莲子心、黄芩清热滋阴，共奏平肝阳、清肝热之功。本研究发现该方可以降低AngⅡ诱导的高血压小鼠的收缩压、舒张压。与模型组对比，该方较好地抑制了由高血压导致的肾小球硬化固缩、肾小管增生、蛋白管型形成，改善肾脏纤维化等。其机制可能与抑制循环肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性，控制血压的升高有关。

中药组方的整体调节特征与辨证观念是从多靶点、多层次的整体较为综合的层面发挥药理学作用，从而达到防病治病的目的。清达颗粒可能是通过有效中药成分调控RAAS的平衡，以此发挥降压作用，改善临床症状，促进肾损害等病理改变的恢复，不仅起到了降低血压的作用，还从整体上保护靶器官的损害。综上所述，清达颗粒能够抑制AngⅡ诱导的血压升高幅度，减轻由于高血压导致的肾损害。本次研究没有对药物剂量梯度进行评价，是否增加剂量能够进一步提高疗效，相关药效机制是什么，与交感神经系统活化、整个RAAS有关与否，是否与血管内皮功能保护有关等等，一系列的问题都值得进一步研究与探索。今后相关研究工作也将沿着上述问题，以及规范的临床疗效评价来开展，也期望能够获得令人满意的结果。