棉花遗传多样性分析SSR标记的快速预筛

姜辉，王永翠，高明伟，王秀丽，陈莹，王家宝，柴启超，张超，赵军胜

（山东棉花研究中心/农业部黄淮海棉花遗传改良与栽培生理重点试验室，济南 250100）

遗传多样性分析是种质资源评价的重要方面，可为育种家在种质创新和亲本选配过程中提供有力参考，使杂交亲本的选择更有针对性，能极大提高杂交后代育种选择效率。在众多用于遗传多样性分析的标记中，DNA 分子标记作为不受环境影响的中性标记，应用最为广泛，基于DNA 分子标记的分析方法成为种质资源遗传背景评价分析的重要手段[1-3]。其中，微卫星标记（Simple sequence repeat，SSR）因具有易开发、多态性好、操作简单、稳定性好、成本低等优点，被广泛应用于作物种质资源亲缘关系分析[4-14]。棉花分子标记数据库CMD（Cotton Marker Database） 曾经公布的棉花SSR 标记有17 448个；陆地棉测序后，南京农业大学棉花所公布了77 996个棉花基因组SSR 标记[15]，均为棉花种质的遗传多样性分析提供了大量的分子标记。但研究表明，棉花遗传基础相对狭窄，大量SSR标记在种质资源中无多态性或者多态性较低[16-23]。在大量分子标记中快速高效地筛选出多态性较好的分子标记，是基于SSR 标记分析遗传多样性的基础，对提高棉花种质遗传多样性分析效率具有重要意义。

本研究拟对改良DNA 混合池法在棉花种质遗传多样性分析SSR 标记快速筛选中的应用进行探讨，并对筛选标记的使用效果进行初步验证，为棉花种质亲缘关系分析过程中多态性SSR 标记的快速筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

60个棉花基因组SSR 标记从CMD 网站下载的文件中随机挑选，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；40 份不同的棉花种质材料由山东棉花研究中心遗传育种室保存提供。

1.2 方法

1.2.1DNA 混池的制作。将40 份种质随机排列，编号1～40。5个样品1个混池，混池编号依次为P1～P8，P1包含材料1～5，P2包含材料6～10，依次类推；每个混合池的第1 样品作为各自的对照。

1.2.2DNA 提取及聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）反应。棉花基因组DNA 提取方法参照文献[24]；PCR 反应体系为10 μL，包括Promega 5×Green buffer 2 μL，10 μmol·L－1dNTPs 0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL；PCR 在T100 型梯度PCR 仪（美国伯乐公司）上运行，程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环，72 ℃后延伸10 min，12 ℃保存。

1.2.3多态性标记的选择。PCR 产物在8%（质量分数）的聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用快速银染法染色。比较混合池与对照间的差异，将差异标记进一步用于单样品的多态性分析。

1.2.4带型判读及数据分析。根据标记带型进行统计，阳性带型为1，阴性带型为0，遗传多样性分析软件为NTsys2.0。

2 结果与分析

2.1 分子标记多态性筛选

经过DNA 混合池筛选，不同分子标记在混合池间的差异表现不同。在60个SSR 标记中，20个分子标记在8个混池之间表现出差异（表1），所占比例为33.3%。多态性标记在混池中差异不尽相同，其中BNL1053、MON5553 等7个标记在8个混合池内都表现出差异；MON0613、BNL3031、BNL827 等6个标记在7个混合池中表现出差异；而MON0362 和MON296 仅在3个混池中表现出差异。

2.2 分子标记多态性验证

为检验该混合池法筛选差异SSR 分子标记的可靠性，用60个标记分别对40个样品单样进行PCR 检测，结果显示，对于20个有差异的标记而言，单样品检测中均表现出不同程度的差异，参见图1（BNL2449 在8个混池中的标记带型）和图2（BNL2449 在部分单样品的标记带型）。对于40个在8个混合池间及对照间没有表现出差异的标记而言，在单样品的检测中也没有发现差异，参见图3和图4（BNL3264 在混池和单样品中的检测结果）。

表1 20个多态性SSR 标记在8个混合池中的多态性表现

图1 BNL2449 在混池间的标记带型

图2 BNL2449 在部分单样品的标记带型

图3 BNL3264 在混池间的标记带型

图4 BNL3264 在部分单样品的标记带型

2.3 混池筛选的分子标记对遗传多样性分析的影响

为了验证混合池筛选出的标记在遗传多样性中分析的效果，分别挑选了在混合池筛选中差异较大的5个标记BNL1053、MON5553、MON022、NAU1043、NAU2083 和差异较小的5个标记MON296、MON0362、NON0707、NAU802 和NAU808，根据2组标记在40样品中的多态性数据，用NTsys 软件进行了聚类分析，结果如图5和图6所示。结果显示图5在遗传相似系数为0.68时可以明显地将40份材料分为3 类，而图6中遗传相似系数为0.78时，40份材料才分成两大类，并有很大一部分种质材料无差异，这说明在遗传多样性分析中可优先选择在混合池中差异较大的标记用于种质的遗传多样性评价。

3 讨论与结论

基于SSR 标记的遗传多样性分析中，标记多态性是无法预判的，只能通过单样品检测才能了解，而且有关提高棉花SSR 标记筛选效率方法的研究较少。王欣怡等[20]提出通过查阅系谱，找出8份亲缘关系较远的材料对586 对候选引物进行初筛，得到190 对初筛引物，用于下一步的遗传多样性分析。这种方法虽然在一定程度上提高了多态性标记的预筛效率，但是需要了解部分种质的系谱信息，这极大限制了其用于系谱信息不全的种质的分析。此外，基于部分种质的预筛会遗漏大部分遗传信息。本研究将改良DNA 混池法用于遗传多样性标记的预筛，包含了所有分析材料的遗传信息。结果表明，该法可有效提高棉花SSR 标记的筛选效率，可以在相对较短的时间内将多态性较好的标记用于遗传多样性分析当中，同时极大降低试验成本。

图5 基于多态性较好的SSR 标记的遗传聚类分析

图6 基于多态性较差的SSR 标记的遗传聚类分析

虽然混池法可提高标记的预筛效率[25]，但在不加对照的情况下，无法显示池内的多态性，只能根据混池之间的带型不同选择标记，容易丢失部分多态性标记。本研究提出尝试在DNA 混合池构建过程中，每个池选择1个随机对照，通过增加不同对照，减少多态性标记漏筛的概率。通过本研究的验证，经过不同混合池与不同对照的两两比对，可有效提高多态性标记的预筛效率。如图1 所示，以P2和P3 为例，通过各自的对照6 和11，可知2个混池内均具有多态性。池内多态性越好的标记，其分析效果越好。

本试验由于所用的材料相对较少，因此采用5个样品混池的方法。在实际应用时，可针对试验材料数量的不同，对每个混池中的样品数量进行调整。此外，本方法的反应条件还需要进一步优化。