同一SSR引物在不同棉种BAC文库中的筛选及其FISH分析

徐俊民，崔兴雷，刘玉玲，彭仁海，周忠丽，蔡小彦，王坤波，刘方*

（1.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000；2.安阳工学院，河南 安阳 455000）

棉属共有8个二倍体基因组，分别是A、B、C、D、E、F、G和K组，这8个二倍体基因组间大小差异明显，其中K 基因组最大（2 460 Mbp），D基因组最小（880 Mbp）[1-2]。棉花的主要栽培种陆地棉和海岛棉是由A 基因组祖先和D 基因组祖先杂交后染色体加倍形成的异源四倍体。研究棉花A、D 基因组的差别将有助于了解棉花基因组的起源进化和结构关系，也将有助于棉花育种的研究进程。

重复序列按照其分布类型可以分为串联型重复序列和弥散型重复序列[3]。串联型重复序列有一定的拷贝数，一般比较保守，在染色体或基因组上成串分布。弥散型重复序列在基因组中弥散分布，在高等植物基因组中占的比例很大，在多倍体植物中所占比例更高，有的在50%以上。重复序列在基因组中的扩增会引起基因突变，导致明显的形态变化，甚至引起数量性状的变化[4]。

对棉花A和D基因组比较研究发现，重复序列含量的不同是造成2个基因组巨大差异的主要因素[5-6]。研究发现，重复序列在棉花基因组间存在扩散和互渗现象，尤其是四倍体中从A基因组向D基因组的扩散，Wendel将这种现象称为“基因组的殖民化”[7-9]。本实验室前期利用简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）引物NAU1201在海岛棉细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）文库中筛选到1个含有重复序列的克隆299N22，研究发现该克隆所含有的重复序列可能对棉花基因组的研究有较大的价值[10]。本研究利用该SSR 引物分别在阿非利加棉文库和达尔文氏棉文库筛选出3个和1个阳性BAC 克隆，用筛选出的BAC 克隆作探针，进行荧光原位杂交（Fluorescencein situhybridization，FISH）试验，并与之前在海岛棉筛选到的BAC 克隆所产生的FISH 结果[10]比较。

1 材料与方法

1.1 引物和BAC文库

SSR 引物NAU1201 被用来筛选阿非利加棉BAC 文库[11]和达尔文氏棉BAC 文库。阿非利加棉BAC 文库共有75 000个克隆，共覆盖阿非利加棉基因组5 倍，插入片段长度集中在100～150 kbp，平均115 kbp，插入片段空载率小于4%。达尔文氏棉BAC 文库含200 832个克隆，共覆盖达尔文氏棉基因组10 倍，插入片段长度平均为122 kbp，空载率小于2%。引物NAU1201 的序列信息来自于网站www.cottonmarker.org，正向引物序列： CCGATAT-CTTACTTTCCAACCT，反向引物序列：AAGGGG-TTTGAAGGGTTATC。

1.2 棉种材料

所选靶染色体为陆地棉、亚洲棉及雷蒙德氏棉的根尖有丝分裂中期染色体。这些材料在中国农业科学院棉花研究所的温室均有活株，并有充裕的种子以供育苗提供根尖。采用宋国立等[12]改良的CTAB 法提取各棉种的基因组DNA。

1.3 BAC文库的筛选

BAC 文库的筛选采用三步聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）筛选法进行[13]。挑取筛选出的阳性单克隆培养，并用十二烷基磺酸钠- 碱裂解法[14]提取质粒DNA，用相应的SSR 引物扩增以验证所提取质粒的质量。菌液PCR 反应总体积为20 μL，DNA 模板1 μL，dNTPs（0.01 mol·L－1）1.5 μL，上下游引物（1×10－5mol·L－1）各1 μL，TaqDNA 聚合酶终浓度0.025 U·μL－1，10×Reaction buffer 2.0 μL，然后用水补足20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性40 s，55℃退火40 s，72 ℃延伸1 min ，30个循环，最后72℃延伸4 min，4 ℃保存。

1.4 荧光原位杂交

种子在温水中浸泡过夜，播种于经煮沸消毒的潮湿的细沙中，置于光照培养箱中待其萌发。待根长至1～3 cm 时取根尖，浸泡于25 mg·L－1的放线菌酮中，22 ℃预处理1 h 40 min，然后用蒸馏水漂洗2 次，最后用卡诺固定液（乙醇与冰乙酸体积比为3∶1）固定2 h 以上。用4%（质量分数）纤维素酶（Cellulase R-10，Sigma） 和2%（质量分数） 果胶酶（Pectinase，Sigma） 混合液在37 ℃下处理根尖40 min，用60%（体积分数）乙酸压片，随后－80 ℃放置4 h 以上，最后揭片，4 ℃保存。阳性克隆质粒用德国Roche 公司的Bio-Nick Translation 标记系统进行标记，按照其标准流程进行操作。荧光原位杂交流程按照Cui 等[10,15]的方法。杂交完成后在荧光显微镜（Ziess Axioskop2 plus） 下观察荧光杂交信号，用Isis 软件拍摄照片并调节对比度和亮度。保存FISH 照片，用Photoshop 软件处理。

2 结果与分析

用SSR 引物NAU1201 分别对达尔文氏棉和阿非利加棉基因组DNA 进行PCR 扩增，用8%（质量分数）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，发现扩增产物与目的片段大小一致。利用三步PCR 法分别筛选阿非利加棉和达尔文氏棉BAC 文库，在阿非利加棉文库中筛选出3个BAC 克隆125C20、28D13 和28D15，在达尔文氏棉文库中筛选出1个BAC 克隆42D12（图1）。

图1 SSR 标记NAU1201 在达尔文氏棉和阿非利加棉BAC 文库的筛选结果

分别用阿非利加棉的28D13 克隆和达尔文氏棉的42D12 BAC 克隆为探针，以陆地棉、亚洲棉以及雷蒙德氏棉的有丝分裂中期染色体为靶DNA 进行荧光原位杂交。结果发现所筛选的BAC 克隆在A（亚）组所有的染色体上都有弥散分布的信号，而在D（亚）组所有的染色体上几乎没有杂交信号（图2，参见封三），该结果与在海岛棉筛选到的BAC 克隆299N22 所产生的FISH 结果[10]一致。

3 讨论与结论

本研究以本实验室在海岛棉BAC 文库中筛选到的1个BAC 克隆为探针，对不同棉种的有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交，发现其在A（亚）组所有的染色体上都有强烈的弥散分布的信号，而在D（亚）组所有的染色体上几乎没有杂交信号[10]。测序发现该BAC 克隆中含有1种重复序列[16]，研究该重复序列对理解棉属的进化有很重要的意义。本研究通过相同的引物来筛选阿非利加棉和达尔文氏棉BAC 文库，均获得了相应的BAC 克隆（图2，参见封三）。这些克隆的获得为研究该重复序列在不同棉种的分布情况以及在不同棉种中的序列差异提供了物质基础。

图2 BAC克隆在不同棉种染色体上的FISH定位

本试验用同一个SSR 引物在3个棉花BAC文库中筛选到相似的BAC 克隆，说明该目标区域在这3个棉种基因组中保守性较强。相同的FISH杂交信号说明BAC 克隆中的这个重复序列在A基因组和A 亚组分布有一致性，该重复序列在异源四倍体形成后没有“入侵”D 亚基因组，其大量扩增应该发生在异源四倍体棉种形成前。上述结果为含有A（亚）组特殊重复序列的BAC 克隆的获得，研究该特殊重复序列在不同棉种基因组中的分布及进化提供了物质基础。

重复序列在棉花的基因组间表现出明显的特异性，其在基因组中的扩增对棉属的进化起到了十分重要的作用[17]。本试验中这些BAC 克隆的发现将对研究棉花基因组结构以及棉花A、D 基因组的起源进化提供帮助，也将有助于推动棉花的比较基因组学研究。