金钱草组织培养及其快速繁殖研究

杨冬业 张丽珍 韦雅芳

摘要[目的]建立金钱草茎段组织培养再生体系。[方法]于4、5月取当年生金钱草茎段为外植体，MS作为基础培养基，研究不同植物生长调节剂对诱导、增殖、生根过程的影响。[结果]MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L适合金钱草不定芽诱导，诱导率为100%;MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L适合继代增殖培养;1/2MS+IBA0.50mg/L+NAA0.1～0.5mg/L适合不定根诱导，诱导率高达100%;组培苗移植到盛有腐殖質花盆中，成活率为100%。[结论]该研究可为金钱草野生种质资源保存和优质种苗生产提供技术参考。

关键词金钱草;组织培养;再生

中图分类号S503.53文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）01-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.028

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

金钱草（LysimachiachristinaeHance.）为报春花科珍珠菜属植物，分布于云南、广西、四川、贵州、河南、湖北、湖南、江苏、陕西、江西、安徽、浙江等地。金钱草味苦、酸、微寒，归肝、胆、肾、膀胱经。清热解毒，利尿排石，活血化瘀，用于治疗肝、胆结石，胆囊炎，黄疸型肝炎，泌尿系结石，水肿，跌打损伤，毒蛇咬伤及药物中毒[1-3]。近年来，国内学者对金钱草在利胆排石方面进行了大量临床应用。对金钱草在排石、利胆利肝、抗炎、抗氧化等多方面的药理作用进行全面分析，发现金钱草对肾结石和胆结石都有防治作用，对治疗肝胆系统的炎症更显优势[4-6]。传统上金钱草繁殖以分株繁殖和种子繁殖为主，亦可扦插繁殖。近年来由于过度的采摘利用，金钱草野生资源几乎枯竭，目前金钱草虽然可以采用种子或扦插进行人工繁殖栽培，但繁殖率低且苗势退化现象严重。植物组织培养是指以离体植物器官、组织、细胞或原生质体，在一定条件下进行培养，并诱导其增殖、分化，建立无性繁殖体系，或获取人类所需要的植物细胞产物的技术过程。应用植物组织培养快繁技术扩大繁殖金钱草是一条较好的解决途径。采用组织培养快繁技术，可以保持金钱草品种优势，避免由于种子繁殖引起杂种分离，并有助于对金钱草抗真菌、抗细菌、抗虫等基因工程研究的顺利进行。笔者利用植物组织培养技术，建立金钱草无性繁殖体系，以期为金钱草人工选育及工厂化育苗提供技术参考。

1材料与方法

1.1材料

试验于2016年3月—2018年6月在桂林师范高等专科学校分子生物学实验室进行。金钱草由广西植物研究所提供，取4、5月金钱草新生枝条为材料进行试验。

1.2方法

1.2.1

不定芽诱导培养。截取粗壮、生长良好的金钱草植株，剪去带柄叶片，用洗洁精清洗腋芽和茎干，自来水冲洗清洗液的泡沫，再用自来水流动冲洗2h。在无菌超净台上，将金钱草茎干剪成带有茎节小段，置于无菌三角瓶中，0.1%升汞消毒10min，无菌蒸馏水清洗2～3次，接种到金钱草不定芽诱导培养基中，培养基中均添加3%蔗糖和0.8%琼脂。置于（25±1）℃的培养室中培养，光照12h/d，光照强度为1000～1500lx，观察并记录其生长情况，分化率=发芽外植体数/接种数×100%。

1.2.2

继代增殖培养。当金钱草侧芽长至2～3cm时，可转接到继代培养基中进行扩大增殖培养，置于（25±1）℃的培养室中培养，光照12h/d，光照强度为1000～1500lx，定期观察并记录生长情况。

1.2.3

生根培养。取生长良好、茎节间均匀、高度3～4cm的苗进行生根培养。截取生长良好的组培苗2～3cm，转接到附加有不同浓度IBA的1/2MS诱导生根培养基中，置于（25±1）℃的培养室中培养，光照12h/d，光照强度为1000～1500lx，观察并记录其生长情况。

1.2.4

移栽。当组培苗植株不定根长至3～5cm时，打开瓶塞，炼苗2～3d，再移植到盛有腐殖质的花盆中，前3d进行遮阴，注意保湿，观察统计组培苗生长情况及成活率。

2结果与分析

2.1金钱草不定芽诱导培养

以金钱草嫩茎段为外植体诱导不定芽发生，建立金钱草高效繁殖再生体系。将金钱草外植体接种到MS诱导培养基后，第8天观察到个别外植体茎节处出现不定芽，20d后观察到不定芽长至1cm左右（图1），30d后观察统计结果。

从表1可以看出，不同浓度的细胞分裂素和生长素配比对金钱草外植体不定芽诱导的影响是不同的。低浓度细胞分裂素和生长素可诱导少数不定芽，而且不定芽生长较快，诱导率较高;高浓度细胞分裂素和生长素可诱导较多不定芽，但容易出现愈伤组织，浓度越高愈伤组织越多。对照组没有不定芽产生，说明植物生长调节剂对金钱草茎段不定芽诱导是必需的。综上所述，金钱草茎段最佳诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L，在此条件下能诱导出较多不定芽，且均为有效芽，茎干粗壮，茎节间距适中，叶片伸展翠绿，适合继代增殖培养。

2.2金钱草继代培养

当金钱草侧芽长至2～3cm时，可转接到继代培养基中进行扩大增殖培养，20d后观察统计结果。

由表2可知，当培养基为MS+6-BA0.2～0.5mg/L+IBA0.02～0.05mg/L时，不定芽粗壮，高达3～4cm，叶片较大伸展，呈嫩绿色，适合用于生根培养（图2）;当培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L时，增殖系数较高，有效不定芽为5～10个，适合用于增殖培养。

2.3金钱草生根培养

取生长良好、茎节间均匀、高度3～4cm的苗进行生根培养，10d左右出现不定根，20d观察统计结果。

由表3可知，金钱草不定根容易诱导，低浓度生长素可诱导出不定根，而且生长良好（图3）。当向1/2MS培养基中添加0.50mg/LIBA+0.1～0.5mg/LNAA组合生长素时，生根率高达100%，组培苗根系旺盛，有气生根，多根毛，叶子深绿，植株健壮，适合移栽。

2.4移栽

当组培苗植株不定根长至3～5cm时，打开瓶塞，炼苗2～3d，再移植到盛有腐殖质花盆中，移栽20d，成活率达100%（图4）。

3讨论

3.1外植体灭菌剂的选择

取自自然界中的外植体，一般

带有多种生长迅速的微生物，其在营养丰富的培养基中会大量繁殖，使得培养基被感染，从而抑制培养物生长。因此初代培养前必须对外植体进行严格的灭菌处理。灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于外植体对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体，一般选用易分解的次氯酸钠，灭菌时间不宜过长;而对灭菌剂不敏感的，一般选用毒性较强的升汞消毒，且灭菌时间适当延长。升汞溶液几乎可以杀死自然界中大部分微生物，是所有灭菌剂中灭菌效果最好的。但是用升汞溶液灭菌也有缺点，就是溶液浓度过高或者灭菌时间过长会毒死幼嫩的外植体，浓度过低或灭菌時间短又不能杀死外植体表面的微生物，使得试验过程中培养基受到污染而发霉长菌。该试验选用0.1%升汞溶液作为金钱草灭菌剂，灭

菌时间为10min。此处理方式，虽然也有极个别金钱草茎段被杀死和感染，但是绝大多数的金钱草茎段都未被污染，达到了很好的灭菌效果。

3.2外植体的增殖及继代培养

外植体进行无菌接种后，随之而来的是外植体不定芽的诱导和生长分化。从外植体分化产生的丛生芽、不定芽数量少，达不到直接生产生根苗的阶段，必须进一步培养增殖，才能达到快速繁殖的目的。在适宜培养基和适宜培养条件下，培养物或外植体能按几何倍数增殖[7]。进行多次增殖培养试验发现，最初2次增殖培养，金钱草植株生长速度较快，一般在20～25d就可以长至5cm左右，植株粗壮、伸展、叶片翠绿，但增殖系数较低。随后继代增殖培养时，金钱草的生长速度比较慢，60d才长至5cm，但增殖系数较高。

3.3不同植物生长调节剂对植物组织培养的影响

在进行金钱草不定芽诱导培养、继代增殖培养及不定根诱导培养时，一般使用6-BA、NAA及IBA等植物生长调节剂。适宜浓度的细胞分裂素与生长素配比有利于不定芽的形成及生长[8]。但若细胞分裂素的浓度过高，会形成过多的不定芽，

从而使不定芽的长势受到抑制，结果使植株过于纤细、密集，小苗不能生长，很难获得健壮组培苗;若细胞分裂素的浓度过低，繁殖系数降低，利于植株生长。在金钱草不定芽诱导培养、继代增殖培养及不定根诱导培养时，植物生长调节剂种类及浓度都在不断地变换，从而使金钱草茎能够快速增殖生长。在培养过程中发现，当添加相同浓度的IBA和6-BA时，主要诱导出金钱草不定根，抑制不定芽生长。IBA浓度过高时，组培苗的叶片缩皱而卷曲，不利于植株生长。

参考文献

[1]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1986：538.

[2]江苏新医学院.中药大词典（上册）[M].上海：上海科学技术出版社，1997：150-151.

[3]中国科学院西北植物研究所.秦岭植物志：第1卷第4册[M].北京：科学出版社，1983：29-54.

[4]李静，胡国全，桂敬强，等.金钱草水提液对小鼠肾脏草酸钙结石形成的干预作用[J].安徽科技学院学报，2014，28（2）：5-11.

[5]李惠芝，姚崇舜，陈济民，等.广金钱草粗提物中多糖的含量测定[J].沈阳药科大学学报，1995，12（1）：21-24.

[6]李静，贺绍君，刘德义.金钱草防治泌尿系统结石机理研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2015，17（3）：79-81.

[7]余伯阳.中药生物技术[M].北京：中国医药科技出版社，2005：195-196.

[8]梁定仁，黄明勋，林伟，等.植物生长调节剂对广金钱草扦插繁殖效果的影响[J].南方农业学报，2016，47（4）：614-617.