低温脂肪酶菌株的诱变筛选及酶学特性研究

王兴吉 贾仁洁 王克芬 刘文龙

摘要以本公司菌种保藏室的产脂肪酶黑曲霉菌株AG007作为出发菌株，通过常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选得到突变株A45-72，其产脂肪酶的活力较AG007提高了86%。再对A45-72进行亚硝基胍（NTG）复合诱变，得到突变菌株GH-73，其摇瓶发酵酶活达到2 350 U/mL，较出发菌株AG007提高了1.2倍，将GH-73传到第10代，其产酶较稳定。摇瓶中添加2.5%橄榄油作为诱导剂时，产酶能力达到2 875 U/mL。通过酶学特性研究发现，其最适作用温度为30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一种低温脂肪酶。

关键词常温常压等离子体;亚硝基胍;复合诱变;低温脂肪酶

中图分类号S-3文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）01-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

脂肪酶（Lipase， EC3.1.1.3）是一类具有特殊酯键的水解酶[1]，它能够催化长链脂肪酸甘油酯的水解，也能够催化该反应的逆反应，除此之外，许多微生物分泌的脂肪酶还能够催化酯交换反应、酸解反应、醇解反应、氨解反应和酯化反应等[2-3]。

微生物脂肪酶是指能够分解或合成高级脂肪酸及丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。微生物脂肪酶种类较多，具有比动物脂肪酶更广泛的温度和pH作用范围，便于工业化生产。目前，它是一种重要的工业用酶，主要应用于食品风味及香味的改进、油脂的水解、低等油脂的改性、皮革绢纺的脱脂、添加于化妆品及洗涤剂中等。特别是在有机合成工业及油脂化工行业中，酶催化的反应具有耗能低、条件温和及成品质量高等优点，具有巨大的应用潜力。

目前，工业上应用的脂肪酶主要是高温和中温脂肪酶，酶的最适作用温度一般在40 ℃左右或者更高，并且在0 ℃左右基本丧失活性[4-6]。低温酶在较低温度条件下仍然具有比较高的酶活，热稳定性下降[7]，因而在食品、洗涤、环保等方面具有广泛的应用。另外，低温脂肪酶还具有热不稳定性的特点，这对于某些工业性的生物催化来说是有益的，例如，在食品的加工过程中，能够在温度较低的条件下快速使酶失去活力，进而避免在酶的热处理失活过程中对食品造成营养损失[8]。

低温脂肪酶是指最适反应温度在30 ℃左右，并且在0 ℃附近仍然具有一定催化活力的脂肪酶[9]。现在低温脂肪酶产生菌大多数来自南北两极和大洋底部等长期处于低温的环境中[10]。尽管产脂肪酶的微生物容易发现，可是，寻找到适合工业生产的脂肪酶生产菌株及其发酵条件却比较困难，而通过传统的诱变筛选能很大程度上提高脂肪酶的产量，使许多脂肪酶实现工业化生产。以本公司菌种室保藏的黑曲霉菌株AG007作为出发菌株，采用ARTP和亚硝基胍复合诱变的手段，获得了一株遗传稳定性良好的高产脂肪酶菌株，并且对其酶学性质进行初步研究。

1材料与方法

1.1材料试验菌株，黑曲霉AG007，本公司菌种室保藏。

1.2培养基

1.2.1种子培养基。葡萄糖1.500%、玉米浆2.000%、硫酸铵0500%、硫酸镁0.100%、磷酸二氢钾1.500%、氯化钙0050%、氯化钙0.600%、磷酸氢二钾2.500%、硫酸亚铁0.030%。

1.2.2富集培养基。葡萄糖1.500%、酪素水解物1.000%、橄榄油乳化液1.500%、硫酸铵0.500%、硫酸镁0.100%、磷酸二氢钾1500%、氯化钙0.050%、氯化钙0.600%、磷酸氢二钾2.500%、硫酸亚铁0.030%。

1.2.3平板初筛培养基。

牛肉膏0.300%、蔗糖1.000%、硫酸镁0.030%、胰蛋白胨0.300%、磷酸二氢钾0.100%、酵母膏0100%、橄榄油乳化液2.500%，0.100%去氧胆钠。

1.2.4斜面培养基。

蔗糖3.000%、硝酸钠0.200%、硫酸亚铁0010%、硫酸镁0.025%、磷酸氢二钾0.100%、氯化钾0050%、硫酸亚铁0.001%、琼脂1.300%。

1.2.5摇瓶复筛培养基。玉米淀粉6.000%、玉米粉1500%、豆饼粉2.000%、蔗糖0.800%、麸皮2.000%、玉米浆1.600%、磷酸氢二钾0200%、硫酸镁0.250%、硫酸铵0300%、硝酸钠0.800%、氯化钙0020%、橄榄油2.000%。

1.2.6Tris缓冲液（pH 7.0）。马来酸2.500%、氢氧化钠2000%、硫酸铵0.200%、硫酸镁0.020%、二水氯化钙0025%。

1.3试验方法

1.3.1孢子悬液的制备。取一只新鲜培养的斜面，加入20 mL生理盐水，用无菌铁铲将其表面的孢子刮下，并将其转移至装有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上振荡打散30 min，用无菌脱脂棉过滤，滤液于10 000 r/min离心5 min，弃上清，菌体用适量的生理盐水重悬，调整孢子浓度在106～107[11]。

1.3.2ARTP诱变。取10 μL制备好的孢子悬液均匀涂布于载片中央，用无菌镊子将载片转移至ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位上，将照射距离调整為2 mm，气流量10SLM，功率100 W，然后设置不同的照射时间进行诱变[12]。

1.3.3亚硝基胍诱变。

1.3.3.1亚硝基胍（NTG）溶液的配制。

在生物安全柜中称取0.035 g亚硝基胍于15 mL无菌离心管中，加入10 mL Tris缓冲液，将离心管置于热水中待亚硝基胍完全溶解，制成NTG母液。

1.3.3.2诱变方法。

在无菌三角瓶中分别按表1加入制备好的孢子悬液、NTG母液及Tris缓冲液（其中，0#为对照组，1#、2#和3#为试验组）。然后将三角瓶于30 ℃条件下振荡反应30 min，反应完毕后将三角瓶里面的液体转移至50 mL离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入45 mL Tris缓冲液重悬，10 000 r/min离心5 min后弃上清，再加入45 mL Tris缓冲液冲洗，反复冲洗3次，以除去残留的NTG，最后加入5 mL Tris缓冲液和5 mL 50%甘油重悬菌体。

1.3.4脂肪酶活力的测定方法。

用聚乙烯醇橄榄油乳化液法测定[13]，一个酶活定义为在测定条件下，每分钟释放1 μmol脂肪酸所需要的酶量。

1.3.5筛选方法。

1.3.5.1初筛方法。将诱变后的菌悬液接种到添加酪素水解物的富集培养基中，30 ℃，200 r/min条件下富集培养2 h。将富集培养结束的菌悬液稀释至适当的倍数涂布平板，30 ℃条件下培养3 d，观察各个菌落周围油脂水解圈的大小及菌落形态，选取水解圈较大或菌落形态发生变化的菌株转接至斜面培养基中。

1.3.5.2复筛方法。挑取斜面长好的菌种接入种子培养基中，30 ℃，200 r/min条件下培养3 d。将长好的种液按10%接种量转接到发酵摇瓶中，30 ℃，220 r/min条件下培养5 d。发酵结束时，将发酵液于10 000 r/min条件下离心5 min，取上清测定酶活。

2结果与分析

2.1ARTP诱变结果

2.1.1ARTP诱变时间的确定。气流量10SLM，功率100 W，将经ARTP处理不同时间的孢子悬液进行适当稀释后涂布于筛选平板上，30 ℃条件下培养3 d，计算不同照射时间的致死率及正突变率，选择合适的诱变时间。

试验结果表明，随着诱变时间的延长，致死率逐渐增加，当诱变时间为40 s时，致死率达到99%以上。通过计算正突变率发现，当诱变时间为30 s时，致死率达到86.7%，而正突变率为25%，此时继续增加诱变时间正突变率随之降低，所以试验中将诱变时间选为30 s。

2.1.2ARTP诱变筛选结果。

经过ARTP诱变，共筛选到10

株酶活提高较大的突变菌株。摇瓶复筛结果表明，这10株正突变菌株遗传性稳定，其酶活提高比例及产孢子结果如表3所示。试验结果可以发现，该10株突变菌株产孢子的量比对照菌株都有不同程度地减少，其中突变菌株A45-72酶活提高了86%，产孢子量最少，所以将其选为下一步NTG复合诱变的出发菌株。

2.2 NTG诱变结果

2.2.1NTG诱变剂量的选择。

在诱变时间为30 min的条件下，不同NTG浓度下的致死率如表4所示。试验结果可以看出，随着NTG浓度的提高，致死率逐渐增加。通过计算正突变率发现，随着NTG浓度的增加，正突变率先上升后下降，当NTG终浓度为25 μg/mL时正突变率最高，此时致死率为80.7%，继续增加NTG浓度，正突变率会相应的降低，所以试验中选择NTG终浓度为25 μg/mL。

2.2.2NTG诱变筛选结果。通过NTG诱变筛选到一株酶活提高较大的突变株GH-73，该突变菌株的摇瓶发酵酶活达到2 350 U/mL，相对于原始菌株酶活提高了1.2倍。该菌株的生长速度比原始菌株要慢，不产孢子。

2.3突变菌株遗传稳定性研究

将突变菌株GH-73连续进行10代培养，以测定其遗传稳定性，试验结果如表5所示，该菌株10次传代酶活均在2 200 U/mL以上，表明该突变菌株的遗传稳定性较好。

2.4诱导剂对菌株GH-73产酶的影响

2.4.1油脂种类对菌株GH-73产酶的影响。某些微生物 只有在诱导物存在时才能产生脂肪酶[14]，采用以上摇瓶发酵培养基，在培养基中添加不同种类2%油脂作为诱导剂，采用上述发酵方法测定酶活，结果如表6所示。可以看出，诱导剂为橄榄油时，诱变菌株GH-73摇瓶发酵酶活最高，酶活为2356 U/mL，表明以橄榄油作为诱导剂时该菌株产脂肪酶活力最高。

2.4.2橄榄油的添加量对菌株GH-73产酶的影响。以橄榄油作为诱导剂，在上述摇瓶发酵培养基中添加不同用量，采用上述发酵方法测定酶活，结果如图1所示。可以看出，在一定的浓度范围内，随着橄榄油添加量的增加，酶活随之增加，当添加量为2.5%时，产酶最高，酶活为2 875 U/mL。此时，再继续增加橄榄油的添加量，菌株产脂肪酶的活力降低。所以，发酵摇瓶中橄榄油的最佳添加量为2.5%。该试验结果与Gupta 等[15]报道的结果相符，油脂浓度的添加量會影响菌株产脂肪酶的能力，随着油脂浓度的升高，菌株产脂肪酶的活力相应上升，但是当油脂添加量过高时，又会抑制脂肪酶的生产。

Fig.1Effect of different volumes of olive oil on lipase production by strain GH73

2.5菌株GH-73酶学特性研究在0～50 ℃范围内测定同一酶液的脂肪酶活力，结果如图2所示，该酶最适温度为

30 ℃，并且在0 ℃左右具有一定的催化活性。在0～30 ℃随

着温度的升高酶活相应上升，当温度超过40℃时，酶活迅速下降，表明该突变菌株产生的脂肪酶为低温脂肪酶。

3结论

通过ARTP和NTG复合诱变，筛选出一株酶活提高1.2倍的高产菌株GH-73，该菌株不产孢子，生长速度相对于对照菌株有所变慢，摇瓶酶活力达到2 350 U/mL，10次传代后酶活力维持在2 300 U/mL左右，遗传稳定性好。

以橄榄油作为诱导剂时，该菌株产脂肪酶活力最高，并且在一定的浓度范围内，随着橄榄油添加量的增加，酶活增加，当添加量为2.5%时产酶最高，酶活为2 875 U/mL。此时，再继续增加橄榄油的添加量，菌株产脂肪酶的活力降低。所以，发酵摇瓶中橄榄油的最佳添加量为2.5%。

对该菌株进行酶学特性研究发现，其最适作用温度为30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一种低温脂肪酶，因此，在食品、洗涤、医药和环保等领域有着良好的应用前景。

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