猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒M蛋白/N蛋白间与N蛋白/3

郑海红 孙竹筠 丛雁方 张可煜 高飞 童光志

摘要：为获得一种经全长cDNA突变体拯救出的、随着传代次数的增多而最终致死的突变病毒，以嵌合感染性克隆p7AX12为骨架，分别在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）M蛋白与N蛋白间或（和）N蛋白/3'UTR之间插入32 nt，依次构建4个嵌合突变体pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，经DNA转染Marc-145细胞后4个嵌合突变体均能拯救出病毒，且拯救病毒中的突变或插入的碱基具有遗传稳定性。突变病毒传代5次，没有最终致死的原因还有待于进一步研究分析。获得的4个突变病毒也为研制PRRSV基因标识疫苗及PRRSV复制转录机制研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）；M蛋白/N蛋白；N蛋白/3'UTR；反向遗传操作

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）03-0010-04

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），是套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）成员之一[1]。该病毒引起的猪繁殖与呼吸障礙综合征（PRRS）给中国乃至世界养猪业都带来了巨大的经济损失。一直以来，免疫接种是控制猪繁殖与呼吸障碍综合征的惟一有效措施，但由于目前现有的PRRSV传统的灭活疫苗和弱毒疫苗各自存在不同程度弱点，因此，高效安全的新型疫苗研发迫在眉睫[2]。随着分子生物学技术的发展和对PRRSV认识的不断深入，尤其是反向遗传操作技术[3，4]的发展，给猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒新型疫苗的研制带来了极大希望。

p7AX12（未发表质粒）是以弱毒株pAPRRS[4]为母体，嵌合了强毒株JX143[5]的N蛋白，并且在基因组M蛋白/N蛋白间引入了外源序列（包括酶切位点、M蛋白与N蛋白重叠4个氨基酸），结果发现，由p7AX12拯救的嵌合病毒v7AX12，在系列传代过程中，基因组M蛋白/N蛋白间引入的外源序列不具有遗传稳定性，出现外源序列逐渐被删除现象。推测删除机制可能是引入的M蛋白与N蛋白重叠序列与PRRSV原本存在的这段序列存在序列重复从而导致了外源序列的删除，此现象类似于真核生物体内一段序列两翼若存在重复序列，这段序列往往被删除的现象[6]。由此，本研究选择N蛋白作为删除目标，试图构建一种突变全长cDNA克隆，转染Marc-145细胞，初期能拯救出病毒，随着传代次数的增多，由于N蛋白被逐步删除缘故，病毒最终死亡。虽有文献表明删除序列大小与正向重复序列大小呈正相关[6]，但是PRRSV作为载体允许插入外源序列长短有限[7，8]。因此，本研究首先分别在N蛋白两端插入相同的35个核苷酸，构建两个全长cDNA克隆，然后在这两个全长cDNA克隆都能拯救出相应突变病毒的前提下，又在N蛋白两端同时插入这35个核苷酸，构建一个全长cDNA克隆，另外，本研究还构建了一个突变体，其N蛋白两端不仅同时插入这35个核苷酸，且N蛋白起始密码子ATG突变成ACG。本研究成功获得了以上4个全长cDNA克隆，并对它们进行了病毒拯救与遗传稳定性特性分析。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒

Marc-145、PRRSV全长感染性克隆pAPRRS[4]、强毒株全长感染性克隆pJXM143[5]以及p7PA3[9]、p7AX12由本研究室保存。细胞生长液为含10%胎牛血清（FBS，Gibco-BRL Cat# 16000）的DMEM（Gibco-BRL Cat# 12430），维持液为含2% FBS的DMEM。Top10感受态细胞购自TIANGEN公司。

1.2 主要试剂

转染试剂FuGENE？誖 HD购自Roche公司，PfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase购自Stratagene公司， QIAprep Spin Miniprep kit、QIAgen Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司，AMV、rTaq购自TaKaRa公司，限制性内切酶购自NEB公司， lexa Fluor？誖 568或者FITC标记羊抗鼠IgG二抗购自Invitrogen公司，免疫荧光试验所用北美型PRRSV 抗N蛋白单克隆抗体由南达科他州立大学（South Dakota state university）方英博士惠赠。

1.3 引物

参照PRRSV弱毒株APRRS株（GeneBank登陆号：GQ330474）和强毒株JXM143株（GeneBank登录号：EF488048）病毒基因组序列，利用Primer premier 5.0软件设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。

1.4 全长突变体的构建

以强毒株JXM143基因组为模板，用pfuTurbo？誖 Hotstart DNA Polymerase扩增，通过突变PCR法获得含有在强毒株JX143 ORF7前加入35 nt（TTAATTAA

CCGGCGGCGCGCCACCATGCCGAACAA，下划线碱基

为酶切位点，斜体为M蛋白与N蛋白间的重叠序列），然后借助p7PA3具有的酶切位点把目的片段替换到p7PA3中，构建pBJ327；通过两轮重叠延伸PCR技术（Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）方法扩增出在强毒株JX143 N蛋白后加入35 nt（与N蛋白前加入的35 nt一致），随后把目的片段连入topo载体中，构建中间质粒topo-732，然后将成功构建的质粒topo-732与全长质粒pAPRRS用SpeI/XhoI进行双酶切、再连接，构建全长pBJ732质粒。以上述构建成功的质粒topo-732为模板，通过突变PCR，获得构建全长pBJD32和 pBJD32R所需突变PCR 片段，并将此突变PCR片段连入topo载体中，构建中间质粒topo-D32和topo-D32R，最后将topo-D32、topo-D32R和pAPRRS用SpeI/XhoI双酶切、再连接构建全长突变体pBJD32和pBJD32R。并用部分测序方法鉴定获得的全长突变体pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R。

1.5 转染

用QIAprep Spin Miniprep kit（QIAgen Inc.）试剂盒提取全长突变体质粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R，采用分光光度计测定各质粒浓度，确定转染量为1 μg DNA的转染体积。接种Marc-145细胞于6孔细胞培养板中，待细胞密度约为80%时进行转染。转染试剂为FuGENE？誖HD，转染后置37 ℃、5% CO2培养箱中培养观察。待Marc-145细胞出现病变且病變达80%左右时收取细胞上清（P0病毒上清）保存于-70 ℃，并在Marc-145细胞连续传代5次，将每代病毒保存于-70 ℃。

1.6 间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence，IFA）

突变体质粒pBJ327、pBJ732、pBJD32和 pBJD32R转染Marc-145细胞72 h时，细胞经冰甲醇固定10 min，1% BSA 封闭， 以抗PRRSV N蛋白的 MAb（1∶600）为一抗，羊抗鼠 IgG（1∶800）为二抗进行IFA试验。具体操作见参考文献[5]。

1.7 突变病毒基因组（genomic RNA，gRNA）的提取及鉴定

采用QIAamp Viral RNA试剂盒提取获得的P5代突变病毒RNA。以提取的RNA为模板，SR15497为引物，用AMV反转录获得cDNA。PCR反应体系为25 μL：0.5 μL rTaq酶，10×PCR buffer 2.5 μL SF14413/SR15497为扩增引物各1 μL，cDNA 1 μL，补充ddH2O至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。获得的突变病毒序列与PRRSV弱毒株APPRS株和强毒株JX143株进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 4个全长突变体构建成功

根据参考文献[9]以及实验室的前期工作，本研究采用突变PCR在PRRSV N蛋白的两端分别或同时插入35 nt，依次构建了pBJ327、pBJ732、pBJD32、pBJD32R 4个全长cDNA，具体构建示意图见图1。pBJD32、pBJD32R 两个全长突变体的不同点是pBJD32R是在pBJD32基础上将N蛋白的起始密码子ATG突变成了ACG。以上突变体获得全长后，经测序分析表明均与最初设计一致，证明成功获得了4个全长突变体。

2.2 全长突变体转染细胞结果

我们用FuGENE？誖 HD Transfection Reagent进行DNA转染。转染前先用QIAgen试剂盒抽提全长克隆质粒。转染全长突变体剂量为1 μg。将Marc-145细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约为80%时进行转染。转染72 h时，IFA试验结果显示，pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R均能在胞浆内检测到N蛋白（图2）。pBJ327、pBJ732、pBJD32R转染后4 d出现细胞病变（CPE），而pBJD32转染后7 d出现CPE（图3）。拯救病毒分别命名为vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R。结果表明，4个突变体转染Marc-145细胞后，均能表达N蛋白且能拯救出相应的突变病毒，暗示突变病毒中的N蛋白在初期的拯救病毒中稳定存在。另外，pBJD32R中的N蛋白起始密码子的突变不影响突变病毒的拯救，暗示N蛋白使用的是引入的M蛋白与N蛋白重叠区中的起始密码子ATG，这与Tan等[9]研究结果一致。

2.3 突变病毒基因组RT-PCR鉴定

将拯救病毒vBJ327、vBJ732、vBJD32、vBJD32R以低剂量感染MARC-145细胞，在MARC-145细胞上传代5次，并对各代次病毒基因组进行RT-PCR鉴定，结果见图4。扩增目的片断为1 074 bp，将扩增的目的片段与pBS-T载体相连，筛选阳性重组子送上海英骏生物技术有限公司进行测序，采用DNAStar软件与亲本感染性克隆pJXM143和pAPRRS进行比对，结果所有嵌合病毒的基因序列均稳定地存在于至少5代的子代嵌合病毒中，并未发现其他突变，具体序列比对见图5。结果表明，获得突变病毒经系列传代，并未出现N蛋白删除的现象，且所有的突变位点都具有遗传稳定性。进一步分析发现，与p7AX12相比，在构建pBJ327时，通过同义突变致使M蛋白/N蛋白间引入的M蛋白/N蛋白重叠序列与PRRSV本身的M蛋白/N蛋白重叠序列不完全重复，由此，推测pBJ327拯救的病毒vBJ327未出现外源序列删除现象，而p7AX12拯救的突变病毒v7AX12中外源序列出现删除现象，这可能与重复序列的重复程度相关，初步证明重复的序列必须完全一致，才能使重复序列间的序列被删除。但本研究遗憾的是vBJD32和vBJD32R连续性传代并未出现N蛋白删除现象，推测出现删除与否还可能与正向重复序列长度以及重复序列间的间隔序列长度相关。因此，在下一步试验将构建含有不同长度的重复序列以及间隔序列长度不一的突变体来验证。本研究结果也为进一步研究PRRSV亚基因组的不连续性转录机制奠定了基础[9]。

参考文献：

[1] SNIJDER E J，MEULENBERG J J. The molecular biology of arteriviruses [J].J Gen Virol，1998（Pt 5），79：961-979.

[2] TIAN K，YU X，ZHAO T，et al. Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS ONE，2007，13：e526.

[3] YOO D，WELCH S K，LEE C，et al. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors[J].Vet immunol immunopathol，2004，102（3）：143-154.

[4] 袁世山，韦祖樟.PRRSV全长感染性cDNA克隆的构建：非结构蛋白和结构蛋白之间编码区的分离[J].中国科学C辑：生命科学，2008，38（1）：66-73.

[5] 吕 健，孙 志，张建武，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建[J].微生物与感染，2007，2（4）：219-226.

[6] ANDREWS R M，GRIFFITHS P G，CHINNERY P F，et al. Evaluation of bupivacaine-induced muscle regeneration in the treatment of ptosis in patients with chronic progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome[J].Eye（Lond），1999， 13（Pt 6）：769-772.

[7] 李清清，姚 静，韦祖樟.以PRRSV为载体表达外源基因的研究进展[J].中国动物传染病学报，2018，26（1）：89-93.

[8] 丛雁方.猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）蛋白编码基因区的反向遗传操作[D].北京：中国农业科学院，2009.

[9] 谭菲菲，张 荣，韦祖樟，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白翻译起始位点的研究[J].畜牧兽医学报，2010，41（7）：847-853.