响应面法优化超声辅助提取桔梗多糖工艺

刘佳，郭少林，陈婷婷，张继业，范清玉

（西安培华学院，陕西西安 710125）

商洛地理位置优越，处于秦岭南麓，因此有着丰富的天然药材，也被誉为天然药库。其中桔梗作为多年生的草本植物，是当地主要的药材类型，药效价值较高，并且有一定的营养价值，在心脑血管预防及宣肺止咳方面疗效明显，市场销售理想。此外商洛地区的桔梗可以食疗，通过研究其化学成分，我们认为其根茎中蕴含着丰富的多糖苷，也就是百姓俗称的桔梗皂苷。此外还含有丰富的多糖，维生素，氨基酸等物质。当前对于其多糖成分的研究还不够深入，更多的是其药理活性价值的分析，临床上认为其可以抗疲劳，降血糖，而接下来对其多糖的工艺制备研究还不够系统与完善，这也是我们后期借助超声辅助技术提取多糖的主导思路。事实验证其成效十分明显，既能大幅缩短提取时间，也能确保多糖的得率。而本文主要以液料比、超声时间、超声温度作为试验因素，基于响应面法探讨超声辅助技术支持下的桔梗多糖提取工艺，以期获得桔梗多糖得率最大限度的提升，推动当地经济发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桔梗药材，采自陕西省商洛市，为3年生桔梗的干燥根茎。

755B紫外光光度计、BILON-1000CT超声波提取器、工业用电子天平、冷冻干燥机、TGL-20bR的高速冷冻离心机、RE-3000B的旋转蒸发仪。

1.2 试验过程

1.2.1 桔梗多糖的制备及含量测定。

获取桔梗根茎，进行初步的粉碎处理，进行石油醚脱脂，进行超声辅助热水回流提取，进行离心处理，获得上清液，液体浓缩，进行乙醇沉淀，进行离心沉淀，采用Sevage法除蛋白透析后进行真空冷冻干燥处理，最终获得桔梗多糖。采用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测量，具体的测量公式为M粗多糖/M桔梗粉末×100%

1.2.2 试验单因素分析

在桔梗多糖制备过程中进行单因素的试验分析。分别选择液料比为20∶1、超声时间40 min、超声温度80℃、超声功率150 W，这些都是试验对照指标，而对应的单因素试验指标为：液料比（10∶1，20∶1，30∶1，60∶1）、超声时间（20、40、60min）、超声温度（40、60、80℃）、超声功率（75、100、125、150W），探讨单因素对桔梗多糖得率的影响。单因素试验分析时，其他因素选择的是固定水平，起到实验对照的积极作用。其中桔梗多糖得率为主要的试验指标，据此绘制单因素曲线图，进行单一因素对其得率的具体影响的试验分析。

1.2.3 响应面优化桔梗多糖提取

综合考虑到单因素的试验结果，对液料比，超声时间，超声温度及超声功率等进行自变量的分析，参考Box-Behnken响应面设计，以桔梗多糖得率作为响应值，分别开展四大因素的响应面试验，借助通用的Design Expert8.06软件进行试验结果的分析。

1.3 数据处理及统计分析

此次试验无论是方案的设计与部署还是模型的建构都使用的Design Expert8.06软件，采用Excel 2016进行收集到数据的处理，采用SPSS18.0软件中的单因素ANOVA进行数据因素的统计分析。

2 结果与分析

2.1 桔梗多糖提取物总糖含量测定结果

基于苯酚-硫酸法测定总糖含量，绘制曲线，如图1所示。标准曲线线性关系中对应的R2数值为0.9965，对应的总糖含量为87.51%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 PGPs制备工艺单因素试验结果

由图2可知，超声温度、超声时间、超声功率、液料比四个因素对桔梗多糖得糖率有明显影响，液料比对桔梗得糖率的影响是呈线性增长的，达到一定程度后趋于平缓。常规情况下，在液料比25∶1时会达到峰值，之后开始缓慢下降。而超声时间对其得糖率的影响属于正态分布模式，呈现先增加后减少的趋势。常规情况下20分钟时达到顶峰。超声温度与桔梗得糖率也是正相关的关系，随着超声温度的提升，桔梗的得糖率明显提升，一般认为70℃为得糖率最高的温度。在这之后逐步下降。最后超声功率对桔梗得糖率也有一定影响，其与超声温度的影响一致，是正相关关系，呈现先增加后减少的趋势。

图2 试验因素对桔梗多糖得率的影响

2.3 PGPs提取工艺优化结果

2.3.1 Box-Behnken设计与试验结果

在单因素分析的基础之上进行综合因素的影响分析，主要是开展液料比、超声时间、超声温度和超声功率与PGPs得率之间的水平响应面试验。基Box-Behnken试验设计原理，辅助Design Expert 8.06试验设计软件和 SPSS 统计软件对综合因素影响结果进行分析，得到桔梗多糖得率（Y）对液料比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）和超声功率（D）的四元二次回归方程：

Y=7.907+0.587A+0.165B+0.072C-0.084D-0.141AB-0.202AC-0.054AD+0.084BC+0.053BD+0.214CD-0.380A2-0.082B2-0.261C2-0.219D2

从方程结果看，液料比的影响性大于超声时间，而超声时间大于超声功率，而超声功率大于超声温度；基于二次项看，液料比、超声温度、超声功率、超声时间依次减弱。

2.3.2 响应面分析

数据拟合后得出回归方程，进行各因素响应曲线的绘制。其中交互作用显著与否受实验因素影响明显，如果响应曲面中曲线走势明显则意味着该因素对桔梗得糖率影响增大。如果曲线平缓则影响小。最终结果显示：液料比的影响最大，其次是超声功率和温度，最后是超声时间。

2.4 最佳工艺参数优化及验证试验

进行Box-Behnken设计工艺优化处理，对应的研究结论是：液料比21.35∶1，超声时间19.53min，超声温度70.3 ℃，超声功率151.53 W，综合这些条件，PGPs得率可达最大值8.172%。此条件下重复5次，PGPs平均得率为8.108%（纯度为87.43%）接近模型预测值，可以在桔梗多糖工业化生产实践中得以运用与推广。

3 结论

多次试验结果表明：采用超声辅助热水浸提桔梗多糖最佳因素组合为：液料比为20∶1，超声时间20min，超声温度70℃，超声功率150W，这些条件综合作用下，桔梗多糖率最高。各因素对桔梗多糖的影响呈现先增后减的趋势。深入分析原因，一般认为桔梗为多年生的草本植物，其多糖成分属于胞内多糖，提取时需要对植物细胞壁进行破除，利用超声波的空化作用延长提取时间确保细胞壁破除率提升，确保多糖得糖率。这也不是绝对的，如果延长超声时间无限制增加，则超声波的空化作用对桔梗的多糖结构起到一定的破坏性，如果持续性的高温也导致多糖得糖率达到顶峰后的急速下降，这些都有学者在试验中进行了验证与论述。