不同生长时期加拿大一枝黄花抑菌效果

陈晶晶

（浙江舟山群岛新区旅游与健康职业学院，浙江舟山 316111）

加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L）原产于北美，在20世纪70年代引入我国，属菊科一枝黄花属，目前已在我国华东地区发展成为一种广泛分布的外来杂草[1]。该物种繁殖力强，已严重影响当地植物及农作物的生态的平衡。国外研究报道其具有抑菌、抗氧化作用，作为药用植物已经具有100多年的历史[2-3]。国内对加拿大一枝黄花的药用价值研究逐渐关注，例如李红军等[4]以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等6种供试菌作为研究对象，研究了加拿大一枝黄花叶提取物的抑菌性、最低抑菌浓度及与一些抗菌药品的抑菌性比较。结果表明：加拿大一枝黄花叶提取物对6种供试菌均有一定的抑制作用。但目前国内相关报道大多关注对加拿大一枝黄花某一部位单一性抑菌比较，对于不同时期和不同部位提取物的抑菌比较鲜有报道，本文通过对加拿大一枝黄花的花前期根、枝叶和花期根、枝叶和花进行抑菌性多项比较，探究它们的抑菌效果，并在此基础上，选取最有效的抑菌部分作抑菌原理探究，为探究加拿大一枝黄花基础研究提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），由当地疾控中心实验室提供。

加拿大一枝黄花全株采集于野外，花前期植株采摘7—8月，花期采摘10—11月，不同生长期植株的根、枝叶、花分开处理，阴干备用。

琼脂培养基和肉汤培养基，北京路桥技术有限公司；立式万用电炉，上海慧泰仪器有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，上海博讯有限公司医疗设备厂；S-3400N扫描电子显微镜，日本日立等。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物制备

称量不同植株样品干品50 g，加入95%乙醇500 mL，放于4 ℃的冰箱内，密封，浸渍，24 h后，低频超声处理30 min，过滤。残渣按照1∶10比例添加95%乙醇，如上处理，反复提取3次，旋转蒸发器减压至适量，获取样品。取适量样品，加入生理盐水，配比浓度约为1 g/mL，高压灭菌备用。

1.2.2 菌悬液的制备

将以上菌株接种在肉汤增菌液中，设置恒定37℃，摇床培养3代，取10 mL到无菌离心管中。设离心机温度为4 ℃，4500 r/min离心10 min。取出离心后溶液，弃上清液，加入10 mL无菌磷酸盐标准缓冲液（pH=7.2），轻轻摇匀，封口，备用。同时做菌悬液细菌总数测定，每个试验对象重复3次。

1.2.3 提取物对致病菌抑菌试验

用移液器分别吸上述加拿大一枝黄花不同提取物9 mL于试管中，迅速吸取1 mL备用菌悬液加入试管中，稍许振荡，2 h后，用移液器吸取1 mL溶液，转移到含有9 mL无菌生理盐水的试管中，稀释102～104梯度，进行细菌总数测定，生理盐水组作为对照组，每个试验对象重复3次。

1.2.4 提取物抑菌扫描电镜

选取抑菌效果明显一组，进行电镜扫描实验。参照1.2.3方法，获取抑菌后液体，用2.5%的戊二醛进行固定后，按照梯度脱水处理，进行CO2超临界、喷金镀膜处理后，采用S-3400N扫描电子显微镜进行拍照处理，同时将未经任何处理的菌悬液同上制备作为对照组。

1.3 数据分析

用软件SPSS18.0进行方差分析，显著性水平设置为p＜0.05。数据结果取平均值±标准差。

2 结果与讨论

2.1 加拿大一枝黄花不同时期不同部位的抑菌比较

从表1看出，加拿大一枝黄花的花期前、花期不同的部位提取物对4种不同菌种有一定的抑制作用。同一种提取物对不同菌种抑菌效果不同，其中金黄色葡萄球菌抑制效果最弱，其他4种菌种的抑菌效果差异性不显著。花期前不同部位相比较，枝叶提取物抑菌效果优于根部提取物。花期不同部位相比较，花提取物抑菌效果最强，枝叶提取物抑菌效果次之，根部提取物最弱。5种不同的提取物抑菌效果，花期抑菌效果最强，枝叶部分提取物抑菌效果次之，根部的抑菌效果最弱，其中两种不同时期的根部抑菌效果都不太理想，这可能和根部质地坚硬，有效物质成分提取不充分，导致有效抑菌成分偏低。枝叶提取物在不同生长时期，表现的抑菌效果差别不显著。综合分析，选用加拿大一枝黄花的花部分提取物进行电镜扫描观察试验。

表1 加拿大一枝黄花不同部分提取物对菌悬液的杀菌效果

2.2 加拿大一枝黄花提取物处理后细菌电镜扫描

在图1～3中，图A、B、C分别是大肠杆菌、副溶血弧、枯草芽孢杆菌未经处理情况下的电镜扫描图，图a、b、c分别是大肠杆菌、副溶血弧、枯草芽孢杆菌的经过加拿大一枝黄花提取物处理后的电镜扫描图。从图A、B、C可以看出，未经处理的三种菌体饱满、光滑，形态完整。图a、b、c可以看出经过处理后，三种微生物的菌体的形态发生改变，表面发生褶皱，菌体聚集，有凝聚现象。有关研究报道通过对加拿大一枝黄花精油成分分析，加拿大一枝黄花含有多种抑菌成分，包括α-蒎烯、柠檬烯、大香叶烯D等，其中所占比重最大是大香叶烯D[5-8]。因此推断在加拿大一枝黄花乙醇提取物中也含有多种抑菌成分。图a、b、c菌体改变，可能是这些抑菌成分共同作用，改变了菌体细胞膜的通透性，细胞内液溢出。

图1 处理前后大肠杆菌变化的扫描电镜图

图2 处理前后副溶血弧菌变化的扫描电镜图

图3 处理前后枯草芽孢杆菌变化的扫描电镜图

3 结语

（1）不同的生长时期的加拿大一枝黄花各部分的提取物对金黄色葡萄球菌、肉芽枯草杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌都表现出一定的抑菌效果，根部提取物抑菌效果最弱，花提取物最显著，可能花部分含有抑菌成分较高的有关。

（2）加拿大一枝黄花花部分提取物抑菌效果电镜扫描观察，菌体皱缩，聚集成团，可能是有效抑菌成分增加菌体细胞膜通透性，细胞内液溢出导致。