红茶中主要影响睡眠成分的溶出规律研究

张冬英，梁青青，刘 帆，伍 欣，张肖娟，余泽恩，黄业伟*

(1.普洱茶学教育部重点实验室,云南 昆明 650201；2.云南农业大学理学院,云南 昆明 650201；3.云南农业大学食品科学技术学院,云南 昆明 650201)

【研究意义】茶是最受人们欢迎的健康饮料之一，茶叶中含有茶多酚、茶多糖、咖啡因等多种功效成分,具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗菌和抗辐射等多种生理功能[1]，红茶约占所有茶叶消费量的80 %，是最主要的茶类之一[2]。红茶富含咖啡因、茶氨酸、维生素A等多种营养元素，茶红素和茶黄素等色素新成分增多，使得红茶干茶呈现乌黑润泽的色泽，红茶冲泡具有红茶红汤、经久耐泡以及滋味醇厚等特征[3]。已有研究表明，红茶具有改善高脂饮食小鼠所引起高血脂以及肝损伤的作用[4]；能够改善去卵巢诱导的大鼠骨质疏松[5]；还能够有效的预防抗生素所诱导的小鼠的肠道菌群失衡[6]，红茶提取物也能够抑制胃癌细胞的生长[7]。正是由于红茶有益于人类的健康，其受到越来越多的人喜欢。然而，众所周知红茶中含有大量的咖啡因，其是中枢神经系统的兴奋剂，也是红茶中滋味苦涩的因素之一，具有明显的兴奋效应[8]。正是由于红茶中富含影响睡眠的物质咖啡因，很多消费者考虑到其有着影响睡眠的副作用，进而限制了红茶的饮用时间以及饮用量。【前人研究进展】氨基酸是红茶中的主要化学成分之一，红茶中含有的氨基酸主要有茶氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)等多种氨基酸[9]，这3种氨基酸在一定条件下可以相互转化，其中茶氨酸和GABA均具有安静、促进睡眠、增强记忆等功效。已有研究表明，茶氨酸有促进睡眠和增强大脑功能和降血压的效果。主要氨基酸(GABA、茶氨酸以及谷氨酸)含量较高的红茶对小鼠具有明显的镇静作用[10]。关于红茶成分分析和功效研究的文献较多，有关红茶中主要影响睡眠成分的溶出规律研究鲜见报道。这些具有不同理化性质的生理活性物质，其水溶性也有较大差异。日常饮茶的冲泡条件和方式影响红茶主要品质成分的溶出，从而导致茶汤滋味和香气等品质特征以及饮茶功效的差异[11-12]。【本研究切入点】本实验以红茶为试样，依据人们日常冲泡红茶的一些习惯(如温度、时间、茶水比)，应用正交试验设计和HPLC法研究红茶中主要影响睡眠成分的溶出特点。【拟解决的关键问题】使人们依据不同的饮茶需要和预期效果(避免饮茶影响睡眠或者需要饮茶以振奋精神等)，通过选择特定的冲泡条件实现对不同品质成分摄入的控制。研究结果能够为人们合理选择红茶的冲泡条件提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

工夫红茶(一级，由陕西安康汉水韵茶叶有限公司提供)；茶氨酸、谷氨酸、GABA和咖啡因标准品(纯度≥98 %，阿拉丁)；乙腈(色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司)；醋酸钠(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；磷酸(色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司)；甲醇(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司)。

1.2 主要仪器与设备

高效液相色谱仪(安捷伦1260)；Agilent ZORBAX Eclipse AAA-C18柱(5 μm 4.6 mm×150 mm，P.N. 993400-902)；超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司SK-18TC)；低速离心机(中佳SC-3616)；移液器；0.45 μm过滤器等。

1.3 实验方法

1.3.1 检测样品的准备 结合人们泡茶的习惯，针对温度( ℃)、时间(min)和茶水比(g/mL)3个因素分别设置3个水平，进行正交试验设计(表1)，每个处理重复3次。精密称量2.00 g红茶样品，在特定的条件下冲泡，过滤得到茶汤，待测。

1.3.2 氨基酸的HPLC检测方法 以乙腈(7 %)和90 mmol/L醋酸钠(93 %)为流动相A(混匀后调pH值至6.5)，B相为80 %乙腈，梯度洗脱(程序见表2)；柱温为40 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量为14 μl；检测时间为25.5 min，检测器设置激发波长为230 nm，发射波长为450 nm[13]。

柱前衍生反应过程如下：用0.5 mL甲醇充分溶解10 mg OPA，加入β-巯基乙醇(30 μl)，震荡使其均匀之后过滤备用。并配制硼酸盐缓冲溶液(0.4 mol/L，pH 10.4)，混匀、过滤后备用。进样程序：抽取硼酸盐缓冲溶液(10 μl)→洗针→吸取OPA衍生试剂(2 μl)→洗针→吸取样品(2 μl)→洗针→混合→进样→洗针。

1.3.3 咖啡因的HPLC检测方法 以5 %的乙腈(配制方法：2842.17 mL水 + 150 mL乙腈 + 9.21 mL磷酸)为流动相A，80 %的乙腈(配制方法：296.085 mL 水 + 1200 mL乙腈 + 4.605 mL磷酸)为流动相B；进样量为10.0 μl；流速为0.70 mL/min；柱温为40 ℃；紫外检测器检测波长为280 nm，按照表3所示的梯度洗脱程序进行检测。

表1 不同冲泡条件正交试验设计表

注：昆明地区水的沸点约为93.5 ℃。

Note: The boiling point of water was about 93.5 ℃.

表2 梯度洗脱程序

表3 梯度洗脱程序

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 HPLC检测氨基酸，咖啡因的校正曲线

校正曲线的绘制：分别精确配制相应浓度的标准品，以标品质量浓度x对峰面积y求出相应的线性回归方程，并绘制校正曲线，结果如图1所示。

咖啡因(A)、茶氨酸(B)、谷氨酸(C)以及GABA(D)在色谱条件下的保留时间分别为22.507、13.993、2.821以及22.507 min，线性回归方程分别为：y=54609.1771x+360.79718、y=26.2531337x+6.3136924、y=44.6905139x+17.278935以及y=89.1198907x-23.720444，相关系数分别为0.99983、0.99742、0.99886以及0.99815。在合理的范围内质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系，可作为精确定量分析方法。

图1 HPLC检测咖啡因(A)、茶氨酸(B)、谷氨酸(C)、GABA(D)的校正曲线Fig.1 HPLC detection of caffeine, theanine, glutamic, GABA calibration curve

表4 咖啡因和氨基酸的含量

2.2 红茶中影响睡眠的主要品质成分的含量

以红茶为试样，应用HPLC法检测其主要品质成分(茶氨酸、谷氨酸、GABA以及咖啡因)的含量，根据上述已得标准曲线进行相关样品含量的计算，成分含量结果如表4所示。

由表5可知，红茶中咖啡因的含量为4.4 %左右，而茶氨酸含量约为1.4 %，谷氨酸含量约为0.2 %。此外，GABA的含量仅达0.07 %，考虑到其含量较低，且其可以与茶氨酸和谷氨酸3者相互转化，在后续溶出规律的研究中笔者只对茶氨酸和谷氨酸进行相关实验。

2.3 冲泡条件对红茶中咖啡因溶出的影响

咖啡因是是组成茶叶滋味的重要物质，是茶叶苦味的主要来源之一。根据正交试验设计，对红茶在不同冲泡条件下咖啡因的溶出率进行了检测和分析，结果如图2和表6所示。

由图2可知，以70 ℃的水温冲泡2 min时，仅有12.5 %的咖啡因溶出。冲泡温度越高、时间越长，咖啡因的溶出越多。以93.5 ℃冲泡10 min时，红茶中约44.3 %的咖啡因溶解到茶汤中。

图2 不同冲泡条件下红茶中咖啡因的溶出率Fig.2 Dissolution rate of caffeine in black tea with different tea brewing condition

由表5可知，茶水比、时间和水温均可显著影(P<0.01)响工夫红茶中咖啡因的溶出。相比之下，时间对工夫红茶中咖啡因的溶出率影响最为显著，水温次之，茶水比的影响相对较小。

2.4 冲泡条件对红茶中茶氨酸和谷氨酸溶出的影响

氨基酸是茶叶中生津润甜的主要成份，是组成茶叶品质特征的成分之一。茶氨酸和谷氨酸作为红茶中含量较高的氨基酸，在不同冲泡条件下的溶出率如图3和表6所示。

表5 咖啡因溶出率的方差分析

图3 不同冲泡条件下红茶茶氨酸和谷氨酸的溶出率Fig.3 Dissolution rate of theanine and glutamate in black tea with different tea brewing condition

表6 茶氨酸和谷氨酸溶出率的方差分析

由图3可以看出，不同冲泡条件下，红茶中茶氨酸(A)和谷氨酸(B)的溶出率大致相同，具有相类似的变化趋势。当水温为70 ℃、冲泡时间为2 min时，茶氨酸和谷氨酸的溶出率均达到40 %左右，相比于咖啡因，红茶中茶氨酸和谷氨酸的溶出相对较快。当水温为93.5 ℃、冲泡时间为10 min时，茶氨酸和谷氨酸的溶出率均达到80 %以上，达到了咖啡因溶出率的2倍。试验发现，在只冲泡1次的条件下，茶氨酸和谷氨酸溶出量随着冲泡时间的延长而逐渐增多；冲泡温度的提高，亦可显著促进氨基酸的溶出。

由表6可知，茶水比、时间和水温均可显著影响茶氨酸和谷氨酸的溶出(P<0.01)，不同因素的影响程度差异也较为显著。这3个因素对茶氨酸和谷氨酸溶出率影响的大小依次为时间>水温>茶水比。

2.5 红茶中影响睡眠的主要品质成分溶出率的比较

为了更为全面地分析红茶中咖啡因和氨基酸溶出情况的差异，选择冲泡温度最低、时间最短的条件“1”和冲泡温度最高、时间最长的条件“9”进行比较，结果如图4所示。

由图4可知，冲泡条件不同，各品质成分的溶出率差异较大。在冲泡条件1下(A)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率相当，约为40 %；咖啡因的溶出率较低，仅达到12.5 %。在冲泡条件9下(B)，茶氨酸和谷氨酸的溶出率相当(超过80 %)；咖啡因的溶出率约为氨基酸的一半(约40 %)。因此，相同冲泡条件下，氨基酸的溶出速度显著高于咖啡因。为了进一步确定有利于促进氨基酸、抑制咖啡因溶出的冲泡条件，以茶氨酸为例对不同冲泡条件下氨基酸溶出率和咖啡因溶出率之比进行了比较分析，结果如图5所示。

方差分析结果如图5所示，在冲泡条件1和冲泡条件4下，茶氨酸溶出率和咖啡因溶出率之比没有显著性差异(P>0.05)，但在这2种冲泡条件下的茶氨酸和咖啡因溶出率之比均显著高于其他冲泡条件(P<0.001)。以上结果说明冲泡时间为2 min，冲泡水温分别为70和80 ℃时，2种成分溶出率之比没有显著性差异，而90 ℃的水温显著降低了茶氨酸和咖啡因溶出率之比。故在冲泡红茶时，为了更好地利用其中的茶氨酸、避开咖啡因，冲泡水温应控制在80 ℃以内。

图4 主要品质成分溶出率的比较Fig.4 Comparison of dissolution rate of the main quality components

“***”表示与冲泡条件1相比差异极显著，P<0.001；“###”表示与冲泡条件4相比差异极显著，P<0.001‘***’ meant very significant difference when compared with brewing condition 1(P<0.001),‘###’ meant very significant difference when compared with brewing condition 4(P<0.001)图5 茶氨酸和咖啡因的溶出率之比Fig.5 The ratio of the dissolution rate of theanine to caffeine

3 讨 论

3.1 关于红茶

茶是一种健康的饮品，具有提神、补充微量元素、抗衰老等作用[14]，而红茶是最受消费者喜爱的茶饮品之一。红茶中含有丰富的氨基酸、多酚、咖啡因等物质。其中氨基酸是主要的含氮物质，具有良好的镇静效果，也是合成许多与代谢产物有关的生理活性物质的先质[15]。茶氨酸和谷氨酸是存在于红茶中的游离氨基酸，为主要呈味物质。GABA是一种非蛋白质天然氨基酸，具有良好的保健功效[18]。红茶中谷氨酸可以转化为茶氨酸和GABA。咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，也是茶叶中滋味苦涩的因素之一。

3.2 关于红茶中主要影响睡眠的成分

已有研究表明，茶氨酸和谷氨酸具有安神、降血压、抗肿瘤、提高记忆力和保护神经等多种生理功能，在食品与保健品领域有着广泛的应用[16-17]。咖啡因具有兴奋神经中枢、消除疲劳、抗忧郁、控制体重、促进消化、改善便秘、利尿、止痛、保护心脏血管等功能[19-21]。试验中所检测的茶样中GABA的含量相对较低，这可能与所选用红茶的制茶工艺有关。因此，后续实验会进一步研究与安神、助眠有关的生理活性物质茶氨酸和谷氨酸以及与影响睡眠有关的咖啡因的溶出规律。

3.3 关于茶氨酸、谷氨酸、咖啡因的溶出规律

氨基酸和咖啡因的溶出量随着冲泡时间的延长而逐渐增多；冲泡温度越高，红茶中可溶性物质溶出量越多。其中，冲泡时间是影响红茶中主要品质成分溶出的主要因素，时间越长，可溶性物质越容易溶出；除此之外，冲泡温度也是影响主要品质成分溶出的因素，温度越高，分子越活跃，运动速度越快，加快了可溶性物质的溶出。茶水比对主要品质成分溶出的影响最小。此外，与咖啡因相比，氨基酸的溶出在相同条件下更多。

4 结 论

研究结果可为消费者科学饮用红茶提供理论参考，以便根据不同需求选择相应的冲泡条件。如需要提神醒脑，可选择高水温、长时间的条件冲泡红茶，使咖啡因充分溶解出来，从而达到兴奋神经中枢、消除疲劳、提神的目的。如需要通过饮茶达到保护神经、缓解压力、改善睡眠和抗焦虑的功效或者睡前饮用红茶，可选择在较低水温、短时间的条件下冲泡红茶，此时咖啡因的溶出量较低，茶氨酸和谷氨酸的溶出量较高，以发挥茶氨酸安神、改善睡眠的功效。对红茶中主要品质成分溶出规律的阐明有助于充分、合理利用红茶的功能成分和保健价值，有利于消费者根据自身需求科学饮用红茶。