海拔梯度变化对中亚热带黄山松土壤微生物生物量和群落结构的影响

赵盼盼,周嘉聪,林开淼,张秋芳,袁 萍,曾晓敏,苏 莹,徐建国,陈岳民,*,杨玉盛

1 福建师范大学湿润亚热带生态地理过程教育部重点实验室,福州 3500072 福建师范大学地理研究所,福州 3500073 福建戴云山国家级自然保护区管理局,泉州 362500

IPCC(2013)报告指出,21世纪末全球气温将平均上升1.8—4.0℃[1]。全球变暖已是不争的事实。当前,气候变化对生态系统的影响是生态学研究的热点问题之一。而在全球气候变化与陆地生态系统关系的研究中,由海拔高度变化引起的自然温度梯度的变化,可以用来模拟气候变化,这也是近年来被广泛应用且经济的方法[2]。其中,土壤微生物是土壤营养源或汇,参与污染物的降解和腐殖化过程[3- 4],在森林生态系统能量流动和养分循环过程起着重要作用[5]。因此,利用海拔梯度变化,了解其微生物多样性的分布格局及其形成机制是未来解释生物多样性对气候变化响应的重要的参考依据。

随海拔升高,温度降低,这可能会影响微生物的活动[6]。土壤微生物群落结构组成十分复杂,数量巨大,单纯的利用传统培养方法取得的土壤微生物信息往往不能全面地反映自然状况下的土壤微生物群落结构变化。近年来磷脂脂肪酸(Phospholipid-derived fatty acids,PLFA)作为微生物的生物标记,常被用于鉴定微生物种类和识别微生物类群[7- 8]。这种方法可以准确反映微生物群落的实际情况[9]。

尽管微生物学方法在不断改进,但是,目前国内外关于土壤微生物群落随海拔梯度的变化并无统一定论。如Whitaker等人[10]研究发现随着安第斯山脉海拔的升高总PLFA含量,Bacteria和Fungi,GN和GP,F∶B均随海拔升高而显著升高。有研究者在阿尔卑斯山观察到土壤Fungi随海拔梯度增加也有相似的结果[11- 13]。而Wagai等人[14]发现,随着海拔的升高,Bacteria和Fungi 含量下降。Djuki等人[15]研究发现,TPLFA及Bacteria 并未随海拔升高表现出一致的变化规律。海拔梯度的变化会影响植被类型[16],而植被类型是影响土壤微生物群落的重要因素,不同树种凋落物和根系分泌物直接影响微生物群落组成[17],此外通过间接影响森林土壤的理化性质,如pH、有机质含量、土壤结构和微气候等,进而对土壤微生物群落产生重要影响[18- 19]。王淼等人[20]在罕山研究表明不同海拔下植被类型不同,显著影响了Bacteria、Fungi、GN和GP生物量以及微生物群落结构组成。由此可知,以往沿海拔梯度的研究大多以不同植被类型作为研究对象,可能是造成研究结果不一的原因。因此,控制植被类型变量,沿海拔梯度,探究微生物群落结构的变化,可能更能反映未来气候变化下土壤微生物的响应。

戴云山国家级自然保护区是东南地区重要的生物多样性的基因库,物种丰富,种类繁多,现已成为研究的热点区域[21- 23]。黄山松(Pinustaiwanensis)又称台湾松,常绿乔木,分布于中国东南部,高山地绿化和用材的优良树种[24],也是亚热带地区的主要建群种。戴云山是中国最大的黄山松种质基因基地[25],对保护福建省乃至我国生物多样性和开展中亚热带植被的演替具有重要科学意义。因此,本研究利用PLFA技术,研究3个不同海拔梯度的黄山松林土壤微生物生物量和微生物群落组成及其影响因素,以期为揭示未来全球变暖背景下微生物群落变化规律提供理论依据,也为探究戴云山自然保护区土壤养分循环的过程提供科学依据。

1 试验区与试验设计

样地位于福建省泉州市戴云山自然保护区(25°38′—25°43′ N,118°05′—118°05′ E),该保护区地处中亚热带向南亚热带的过渡区域,是中国单位面积生物多样性程度最高的自然保护区之一。气候类型为亚热带海洋性季风气候,具有冬冷夏热,水热同期,湿润多雨等特点。年平均气温20℃,年降水量达1700—2000 mm,年平均相对湿度80%[26]。不同海拔梯度的黄山松林的主要优势树种均为黄山松,林内其他乔木较少,林下植被相似,1300,1450 m海拔和1600 m海拔相比灌木较多,林下灌木层优势树种以肿节少穗竹(Oligostachyumoedogonatum)为主,伴生有钝齿冬青(LlexcrenataThunb)、鹿角杜鹃(Rhododendronlatoucheae)、窄基红褐柃(Euryarubiginosavar.attenuata)和短尾越桔(Vacciniumcarlesii)等；草本层以里白(Hicriopterisglauca)为主,伴生有德化假卫茅(Microtropisdehuaensis)、藜芦(Veratrumnigrum)、狗脊蕨(Woodwardiajaponica)和黑莎草(Gahniatristis)等,土壤均为花岗岩发育的黄壤。样地基本情况详见表1。

表1 不同海拔土壤样地基本情况

2 研究方法

2.1 土壤样品采集

2017年5月,选取戴云山1300、1450、1600 m 3个海拔的黄山松林,于每个海拔梯度设置20 m×20 m的标准样地,在每个标准样地内随机布设5个2 m×2 m小样区,去除表面凋落物,每个小样区采用“S”型混合采样方法取样,取表层土,土层深度约为10 cm,每片林子采集5个土壤样品。将采集的土壤样品迅速带回实验室保鲜。去除可见根系、石粒等及动植物残体后,将土壤过2 mm筛。然后将土样用四分法分为两部分,一部分用于土壤速效养分、含水率、土壤微生物生物量和微生物群落结构的测定；另一部分土壤室内自然风干后过0.149 mm筛,用于测定土壤全氮磷等基本理化指标。

2.2 土壤理化性质测定方法

2.3 土壤微生物生物量碳、氮、磷及微生物群落结构(PLFA)测定

微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[28],最后用总有机碳分析仪测定提取液中有机碳含量,用连续流动分析仪测定总氮含量。MBC计算公式：BC=ΔEC/kC,式中：ΔEC为熏蒸与未熏蒸土壤有机碳含量的差值,kC为转换系数,取值0.45。MBN计算公式：BN=ΔEN/kN,式中：ΔEN为熏蒸与未熏蒸土壤有机氮含量的差值,kN为转换系数,取值0.54。土壤微生物生物量磷(MBP)采用氯仿熏蒸-NaHCO3浸提法[29],MBP计算公式为：BP=ΔEP/kP,转换系数kP取值0.40。

微生物群落结构(PLFA)具体参考Bossio和Scow[30]的方法进行样品的浸提、分离、酯化、萃取,采用MIDI软件系统分析PLFA各组分含量。具体步骤：称取相当于8 g干重的新鲜土壤,置于离心管中,加入提取液(氯仿∶甲醇∶磷酸缓冲液体积比为1∶2∶0.8)后振荡2 h,然后在2000g离心10 min,将上清液倒入加有12 mL氯仿和12 mL磷酸缓冲液的分液漏斗中；下层沉淀再用23 mL提取液重复提取1次。两次的提取液混合摇匀,静置过夜。第2天将分液漏斗中的氯仿层小心接入试管中,在30—32℃水浴中用高纯N2吹干。浓缩的脂肪酸用1 mL氯仿分5次转移到活性硅胶柱中,分别用氯仿、丙酮和甲醇洗提,弃去氯仿和丙酮洗提液,收集甲醇洗提液,在32℃水浴中用高纯N2吹干后,依次加入1 mL甲醇∶甲苯(体积比1∶1)混合液和1 mL 0.2 mol/L KOH 甲醇溶液,振荡混匀,在37℃水浴中处理15 min。之后加入0.3 mL 1 mol/L醋酸、2 mL正己烷和2 mL纯水,低速振荡10 min,提取上层溶液；剩余溶液用2 mL正己烷重复提取1次,两次提取的上层溶液混合后,用高纯N2吹干,得到甲酯化的脂肪酸样品。该样品用200 μL正己烷溶解,以19:0甲酯作为内标物,在气相色谱仪(Hewlett-Packard 6890 series GC,FD)上采用MIDI软件系统(MID,IInc.,Newark,DE)进行分析,测定磷脂脂肪酸各组分的含量。具体的土壤微生物种群磷脂脂肪酸标志物及其特征比值详见表2[31-35]。

表2 土壤微生物种群磷脂脂肪酸标志物

2.4 数据处理

数据经过Microsoft Excel 2013软件处理后,采用SPSS 21.0统计软件对不同海拔土壤各指标进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验不同处理之间土壤理化性质,土壤微生物生物量及土壤微生物群落结构的差异显著性(Duncan法,α =0.05)。采用Canoco Software 5.0软件,以土壤微生物PLFA为响应变量,以土壤理化性质及微生物生物量为解释变量做冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)；绘图由Origin 9.0软件完成。

3 结果与分析

3.1 土壤基本理化性质

3.2 不同海拔对微生物生物量及其比值的影响

MBC、MBN和MBP含量均随海拔升高而降低,但是不同海拔之间的MBC含量的差异性未达显著水平,而海拔1300 m的MBN和MBP含量显著高于海拔1450 m和1600 m的MBN和MBP含量(P<0.05)(表4)。随海拔升高,MBC∶MBN 并无显著变化。和1300 m海拔相比,1450 m和1600 m海拔MBC:MBP分别显著增加了2.68倍,2.12倍,MBN∶MBP分别显著增加了1.33倍,1.44倍(图1)。

表3 不同海拔土壤基本理化性质

表4 不同海拔对微生物生物量的影响

表中数据为平均值±标准差(n=5),同一列不同小写字母表示同一土层不同海拔间差异显著(P<0.05)

图1 不同海拔处理下对土壤MBC∶MBN,MBC∶MBP,MBN∶MBP比值的影响Fig.1 Effects of different altitudes on soil MBC∶MBN,MBC∶MBP,MBN∶MBP ratiosMBC:微生物生物量碳,Microbial biomass carbon; MBN:微生物生物量氮,Microbial biomass nitrogen; MBP:微生物生物量磷,Microbial biomass phosphorus

3.3 不同海拔土壤中特征微生物类群PLFA 总量及其比率

不同微生物相对生物量在不同海拔土壤中分布不同。其中Bacteria生物量最大,其次是Fungi,ACT。随海拔升高,AMF,GN,Fungi,TPLFA含量随之下降(表5),均为1300 m>1450 m>1600 m,和1300 m海拔相比,1600 m海拔GN含量下降了0.37倍。而海拔变化对GP和ACT无显著影响。和1300 m海拔相比,1600 m海拔的GP∶GN显著增加了34.69%。F∶B比值在1450 m海拔最低,和1300 m海拔的F∶B比值相比,1450 m海拔的F∶B比值显著下降了33.73%。

表5 不同海拔对磷脂脂肪酸及其特征比值的影响

表中数据为平均值±标准差(n=5),同一行不同小写字母表示不同海拔间差异显著(P<0.05)

3.4 土壤微生物群落结构变化的RDA分析

以土壤微生物PLFA作为响应变量,土壤的理化性质作为环境解释变量进行RDA分析(图2)。不同海拔梯度都按照一定的规律进行了很好的聚类,说明不同海拔处理显著影响了表层土壤微生物PLFA。RDA分析表明T和DON是影响表层土壤PLFA变化的关键因子。RDA第一轴和第二轴分别解释了变量的56.48%和9.90%,其中气温(T)作用最明显,解释了土壤微生物群落结构变化的41.1% (P=0.002),且与AMF,Fungi,TPLFA呈显著正相关,与F∶B显著负相关。

图2 不同海拔对土壤微生物群落结构影响的冗余分析Fig.2 Correlations of soil phospholipid fatty acid to soil properties as determined by redundancy analysis (RDA)GN:革兰氏阴性菌,Gram-negative bacteria; ACT:放线菌,Actinomycetes; AMF:丛枝菌根真菌,Arbuscular mycorrhizal fungi; TPLFA:总磷脂脂肪酸,Total phospholipid fatty acid; GP∶GN:革兰氏阳性菌∶革兰氏阴性菌,Gram-positive bacteria∶Gram-negative bacteria; F∶B:真菌∶细菌,Fungi:bacteria; DON:可溶性有机氮,Dissolved organic nitrogen; WC:含水率,Water content; T:平均年气温,Temperature; 铵态氮,Ammonium nitrogen

4 讨论

4.1 不同海拔下微生物生物量及其比值的差异

土壤微生物量是土壤微生物发挥作用的物质基础,由于其周转快、灵敏度高,可以直接或间接反映土壤肥力和土壤环境质量的微小变化[36-37]。MBC和MBN分别是有机碳和有机氮中最活跃、最易变化的部分,虽然所占比例很小,却是整个生态系统养分和能源循环的关键和动力[38],而MBP则反映着土壤中有机-无机磷素的转化过程。本研究中,MBN和MBP均随海拔降低而显著升高。这是因为海拔1300 m地区温度较高,有效促进了微生物的生长及活性,加速其对无机养分的利用。同时促进了MBC的积累,但随海拔下降MBC含量有升高趋势并不显著。这与刘秉儒[39]的研究结果并不一致,其结果表明贺兰山东坡(1400—3100 m)土壤MBC和MBN随海拔的升高而增加。土壤有机质含量是影响土壤微生物量的重要因素[40- 41],贺兰山高海拔地区SOC、TN含量较高,进而增加MBC、MBN含量,然而本研究海拔1600 m地区的SOC、TN含量相比于海拔1300 m地区更低,因此MBC和MBN含量随海拔升高下降。

4.2 不同海拔下微生物PLFA的变化及其驱动因子

土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分,参与土壤有机质分解,养分循环及氮的固定[43],是研究和预测陆地生态系统对全球变化响应的重要对象。随着全球变化的进程,预计在本世纪末,全球高海拔和高纬度生态系统的气温将增加0.6℃[44]。海拔梯度的变化会导致温度、光照、水分等多种环境因子的改变,引起山地区域小气候、土壤理化特征等环境系统的梯度效应,进而影响土壤微生物生物量、活性及群落结构[13,45]。目前,关于土壤微生物的海拔梯度分布规律的相关研究还很少,土壤微生物分布规律有待进一步揭示[13]。

本研究表明,随海拔升高,AMF,GN,Fungi,Bacteria,TPLFA含量显著下降。同时,海拔梯度影响土壤养分含量(表3)。土壤养分含量对微生物群落起着重要的作用,其数量和质量可以影响真菌生长[46],被认为是决定土壤微生物生存、物种组成和代谢的关键因素之一[47]。有研究表明微生物的特征PLFAs含量与养分的可利用性呈现正相关关系[48]。本研究中发现随海拔梯度变化微生物PLFA与SOC,TN,TP,MBC,MBN,MBP变化趋势一致,其含量均随海拔升高而降低。这与Wagai等人[14]研究结果一致,随海拔升高,土壤Fungi、Bacteria含量也下降。其主要原因是高海拔地区微生物受到底物的限制作用。然而Siles和Margesin[49]研究表明,高海拔地区,细菌相对丰度增加,这与该地区土壤有机质及养分含量更加丰富有关。本研究中,高海拔地区C、N、P养分含量减少,这是因为海拔1600 m处黄山松植株矮小,黄山松凋落物归还较少,同时植被的稀疏增加土壤养分淋失的风险。Bardelli等人[50]研究表明不同海拔地区表层土壤的细菌和真菌群落均受到总碳含量的显著影响。因此,微生物丰度的变化可能主要受到养分的限制。

F∶B和 GP∶GN的比值常被用作指示微生物群落结构变化的重要指标[51]。F∶B可表征细菌和真菌两个种群的相对丰富程度消长状况[52],F∶B比值越高,表明生态系统越稳定[53]。研究表明,海拔梯度并非是驱动土壤F∶B的关键因子,F∶B随海拔高度有相似[11]或相反[13,54- 55]变化趋势。许多研究认为pH的变化是土壤中优势真菌和细菌的主要驱动力[49,56]。而Kotas等人[57]研究表明除pH值外,F∶B与土壤有机质和含水量也有很大的关系。本研究地区,3个不同海拔pH并无显著差异,但有机质含量则显著不同,1300 m海拔地区SOC含量富集促进真菌生物量增长,进而提高真菌菌丝体与土壤有效养分的接触面积,减少土壤养分流失,因而1300 m海拔地区土壤生态系统更稳定。

GP和GN对底物的倾向性及生长策略的不同,常用于指示环境变化下,微生物群落结构变化的指标[58]。与GN相比,GP更容易适应底物有效性低的环境[59],主要以K策略物种为主。高海拔地区,土壤碳、氮、磷以及速效养分含量较少,资源相对贫瘠,GP可以较好的适应这种不利环境,其生物量并未发生较大的改变。而GN生长则受到抑制,其生物量随海拔升高而降低。因此造成,随海拔升高,GP∶GN显著增加。这与Huang等人[60]在大安山地区研究结果一致。

5 结论

在3个不同的海拔梯度下,WC、SOC、TN、TP、MBN、MBP和Fungi、Bacteria、TPLFA随海拔升高显著下降。随海拔升高GN:GP显著增加,在资源相对贫瘠的1600 m海拔地区,GP比GN更具竞争力,而F∶B比值随海拔升高有下降趋势,说明真菌比细菌对海拔的响应更敏感。冗余分析表明,T和DON是影响不同海拔梯度表层土壤微生物群落结构发生变化的主要环境因子,因此它们制约了1600 m海拔地区微生物活动及分解作用。未来全球气候变暖背景下,将改变土壤碳氮磷养分含量及微生物生物量,从而影响土壤微生物群落结构发生变化,这对进一步深入了解气候变化对山地生态系统土壤养分循环具有重要意义。