不同煎煮时间的银翘散对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响

张 茹，闫婧璇，刘 玥，于乐海，李美星，常雪菡，郑志娟

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

银翘散出自清·吴瑭的《温病条辨》，由金银花一两、连翘一两、苦桔梗六钱、薄荷六钱、竹叶四钱、甘草五钱、荆芥穗四钱、淡豆豉五钱、牛蒡子六钱，芦根六钱[1]组成，该方具有清热解毒的功效。霍炳杰等人[2-4]认为煮沸后3min对外周血T细胞亚群影响作用较强，3～6min银翘散对甲型流感病毒疗效最佳。故通过对银翘散煮沸后0～6min的HPLC谱图及小鼠脾脏T、B淋巴细胞体外增殖情况探讨银翘散的最佳煎煮时间。

1 仪器及试药

1.1 仪器

LC-10ATvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)；超净台；MemmentCO2培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)等。

1.2 药材

金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、苦桔梗、芦根、淡豆豉、生甘草、竹叶、荆芥穗，购于安国市久旺药业有限公司。

1.3 试剂

对照品绿原酸、连翘苷、牛蒡子苷均为分析纯购自成都德思特生物技术有限公司，环磷酰胺(CY)，甲醇(色谱纯)，磷酸，脂多糖(LPS)，刀豆蛋白(ConA)，噻唑蓝(MTT)， RPMI 1640培养基，胎牛血清。

1.4 其他材料

SPF级小鼠，雌性，体重18～22g。

2 方法

2.1 色谱

2.1.1 色谱条件

Innoval ODS-2柱(4.6mm×150mm;5μm)，流动相甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)梯度洗脱(0～1min，1%～2%A;10.01～30min，2%～15%A;30.01～50min，15%～20%A;50.01～80min， 20%～40%A;80.01～100min，40%～43%A)，检测波长237nm，流速1.0mL/min，柱温30℃。

2.1.2 供试品溶液制备

将上述十种药品打粉，按照比例(水与总药量比例为5∶1)提前浸泡1h,然后进行煎煮，煮沸时间分别为0、1.5、3、4.5、6min。

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品，绿原酸0.0038g，连翘苷0.0046g，牛蒡子苷0.0064g，用甲醇定容。

2.2 细胞实验

2.2.1 小鼠前期准备

小鼠连续15天注射环磷酰胺(60mg/kg×bw)。

2.2.2 制备小鼠脾脏淋巴细胞

第16天将小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3～5min,在超净台内分离脾脏，放在盛有适量PBS的培养皿中，剥离脂肪与筋膜组织，置于200目筛网用无菌注射针针芯轻轻研磨，收集细胞悬液，加入Tris-NH4Cl裂解红细胞，静置5min，800r/min离心10min[5]，弃上清。收集细胞悬液，稀释成(2.0×106)mL，备用。

2.2.3 实验分组

RPMI 1640完全培养液即为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基[6]。

空白对照组：完全培养液；LPS对照组：完全培养液+10μg/mL LPS；ConA对照组组：完全培养液+10μg/mL ConA；T淋巴细胞组：ConA+不同煎煮时间银翘散；B淋巴细胞组：LPS+不同煎煮时间银翘散

2.2.4 MTT法检测细胞增殖情况

取稀释好的脾脏细胞悬液100μL置于96孔细胞培养板中，根据2.2.3实验分组进行加药，最终每孔体积为200μL，置于37℃、5%CO2培养箱里培养24h后，加入MTT继续培养4h，每孔吸弃100μL上清液，加150μ LDMSO,混匀，恒温振荡5min，酶标仪于570nm处测得吸光度值。

3 结果及讨论

3.1 银翘散及其三种主要成份分析

通过印酬等人[7]推断银翘散中主要起作用的为金银花、连翘、牛蒡子，故选取其三种药材的主要成分作为对照品(绿原酸、连翘苷、牛蒡子苷)，根据2.1.3配制的对照品进行检测，峰1、2、3分别为绿原酸、牛蒡子苷、连翘苷。

图1 三种对照品HPLC谱图

图2 样品HPLC谱图

峰号 S0 S1 S2 S3 S4 S5 平均 RSD/%10.494 0.506 0.507 0.506 0.505 0.504 0.504 0.96420.966 0.966 0.966 0.964 0.964 0.967 0.966 0.10431.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000

表2 相对峰面积

3.2 不同煎煮时间银翘散对小鼠脾脏淋巴细胞增殖影响

由表3可知，不同煎煮时间银翘散与ConA共同影响免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞增殖，在1.5min时最佳；与LPS共同影响免疫抑制小鼠脾脏B淋巴细胞增殖，在3min时最佳。

表3 不同煎煮时间银翘散对免疫抑制、对照小鼠脾脏B/T淋巴细胞增殖的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

4 小结与讨论

银翘散因其某些成分具有挥发性，故不能过度煎煮，把握好煎煮时间便是关键。与此同时，刘险峰[8]认为传统煎煮方法疗效较佳，束雅春等人[9]发现在传统煎煮方法下薄荷、荆芥穗后下煎煮3min、5min效果较好。

本研究通过对银翘散中三种主要成份的HPLC谱图的相对保留时间及相对峰面积进行对比，可以得出不同煎煮时间银翘散中所含成分含量不同；通过对免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖可以得出不同煎煮时间的银翘散对脾脏T、B淋巴细胞体外增殖影响不同。