柑桔胚乳培养体系的建立与优化

李海林，聂振朋，柯甫志

（1台州科技职业学院农业与生物工程学院，浙江台州 318020；2浙江省柑桔研究所）

我国是柑桔的重要原产地之一，柑桔资源丰富，优良品种繁多，经过长期栽培、选择，柑桔成了人类的珍贵果品。柑桔果实既可鲜食，又可加工成果汁，深受广大消费者的喜爱。我国柑桔品种资源虽然丰富，但栽培的品种多是有核甚至多核的，因而影响了商品价值和在国际市场上的竞争力[1]。

无核柑桔果实以其食用方便、品质优良而倍受人们的青睐，其无论在鲜食和加工上都具有重要意义。无核柑桔，育种上指平均单果种子数在3粒以下[2]，在商业上指平均单果种子数在5粒以下[3]。柑桔无核果有很多是天然形成的，但大部分无核品种是人为选育出来的。胚乳是双受精产物之一，由1个精核和2个极核融合而成，是三倍体组织，由胚乳再生的植株通常也是三倍体，可产生无子果实。通过胚乳培养获得三倍体植株，技术要求不高，三倍体得率高，嵌合体少，育种周期短，柑桔胚乳的离体培养是获得三倍体无籽柑桔的重要途径[4]。通过研究柑桔胚乳三倍体植株的诱导，以期获得无核的三倍体胚乳再生植株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柑桔果实取自台州科技职业学院果园，以果龄2个月左右的柑桔幼果为宜。

1.2 试验方法

1.2.1 幼果处理。将新鲜果实，用70%乙醇浸泡30s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡6～7min，然后用无菌水冲洗3～4次，每次3～5min。再用干燥的无菌滤纸吸干种子表面的水分后，然后将果实放在灭菌培养皿内。

1.2.2 取胚乳。用流水冲洗预处理后的柑桔幼果30min左右，剥离出种子，将种子用0.1%HgCl2消毒6～7min。再用无菌水冲洗4～5次，每次3～5min。在超净工作台无菌条件下，在种子的合点端纵剖1刀，打开种子取出胚囊。轻轻挤压胚囊的胚端，挤出幼胚，剥离出胚乳，选择半透明状固体、富有弹性的胚乳，单独接种。

1.2.3 愈伤组织诱导。所用培养基以MS为基本培养基，对6-BA、2,4-D、sucrose浓度利用Minitab软件正交设计优化。正交设计的因素及水平分别为6-BA浓度 （0.5、1.0、1.5mg/L），2,4-D 浓度（0.2、0.4、0.6mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（见表 1）。每个处理接种 l0 瓶。及时对其进行形态观察，50～60d后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=愈伤组织块数／接种个数。

1.2.4 不定芽诱导。获得胚乳愈伤组织增殖培养后，接种于不定芽诱导培养基。以MS培养基为基本培养基，对TDZ、NAA、sucrose浓度利用Minitab软件正交设计优化。正交设计的因素及水平分别为TDZ浓度（0.5、1.0、1.5mg/L），NAA 浓 度 （0.1、0.2、0.3mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（见表 2）。每处理每次接种 20 块愈伤组织。不定时观察愈伤组织动态变化，50～60d后统计不定芽发生情况。

1.2.5 组培苗倍性鉴定。将不定芽接种于MS培养基中，培养2～3周成苗。利用流式细胞仪对组培苗倍性进行鉴定。鉴定方法参照陈城[5]报道的方法。

培养基pH值5.8～6.2。培养条件均为：温度25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx，琼脂0.7%，活性炭浓度1.0mg/L。

表1 愈伤组织诱导正交设计因素水平表

表2 不定芽诱导正交设计因素水平表

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

由表4可知，3种因子对柑桔愈伤组织诱导产生效应的大小依次为6-BA＞2,4-D＞sucrose。说明同种类培养基中，不同浓度的6-BA对柑桔愈伤组织诱导的影响较大，2,4-D次之，而sucrose的影响较小。鉴于以上分析，结合表3可知：柑桔愈伤组织诱导最佳组合为A2B1C2，也就是蔗糖6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈伤组织诱导率可达30%。

表3 愈伤组织诱导培养基正交试验L9（33）

表4 方差分析表

2.2 不定芽诱导

由表6可知，3种因子对不定芽诱导产生效应的大小依次为TDZ＞NA＞sucrose。说明同种类培养基中，不同浓度的TDZ对柑桔愈伤组织诱导的影响较大，NAA次之，而sucrose的影响较小。鉴于以上分析，结合表5可知：柑桔不定芽诱导最佳组合为A1B2C2，也就是TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽诱导率可达35%。

表6 方差分析表

2.3 植株形成与鉴定

不定芽在MS培养基培养2～3周形成再生植株。鉴定结果如图1。

图1 倍性鉴定结果

3 结论

Gmitter[6]以及赵咏望等[7]早在20世纪90年代就从甜橙品种的胚乳中诱导出了三倍体植株。本试验采用正交设计，研究不同激素的种类、浓度及其配比对柑桔组织培养的影响，与传统试验相比，本试验能容纳更多的因素和水平，大大减少了试验次数，提高准确率[8]。利用流式细胞仪鉴定植物染色体的倍性，不受植物生长发育时期和环境条件的影响，取材部位可以是根、茎、叶片、花、果实、种子等器官，具有快速、准确、简单、高效的特点。已经成功应用于果树、蔬菜、花卉等植物的倍性鉴定中[5]。试验结果表明，不同的激素配比对柑桔胚乳愈伤组织和不定芽的诱导有很大的影响。本试验中柑桔愈伤组织诱导最佳组合为：6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈伤组织诱导率可达30%；柑桔不定芽诱导最佳组合为：TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽诱导率可达35%。