一株解脂菌的鉴定及解脂能力研究

王帮香，李林辉

(西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637002)

随着食品行业的发展，排放在废水中的食用油脂含量日益增高，加剧了环境污染等问题[1-2]。我国对含油污水的生物处理方法主要是活性污泥法，但是存在能力低、效果差等缺点[3]。因此，基于微生物能利用油脂作为生长所需要的碳源和能源的原理处理油脂污水的研究不断增多[4-5]。目前国内外研究油脂分解菌的较多，研究进展显著，但很少从油杉等天然物质中提取野生菌种，而且相关文章对其所研究菌株的油脂降解能力并未做具体测试。油脂降解菌类的研究仍处于初级阶段，其解脂能力测定及应用价值还有待进一步开发。研究油脂降解菌可以对油脂类污染水体进行处理，改善环境、为环保事业提供研究科学依据与参考。本文以国内外研究的空白点为出发点，从油杉树生长的土壤中筛选出可以高效分解油脂的菌株，对其做酶活力测试，并对该菌进行鉴定，测其种属及分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 菌种采集自南充市金城山的松树油脂。

1.1.2 培养基 富集培养基、分离培养基、初筛培养基及复筛培养基参考《高效油脂降解菌株的筛选及特性研究》[5]略作改动，文中所用橄榄油换为菜籽油(5.0g/L)。

1.1.3 16S rDNA扩增引物及体系[6]

1.2 方法

1.2.1 菌种的筛选 对采集到的野生菌种进行富集培养、菌种分离、菌株初筛及复筛[5]。

1.2.2 鉴定

1.2.2.1 菌株形态学鉴定 在培养基上观察菌株的菌落特征[7]。

1.2.2.2 生理生化鉴定 对筛选出的菌株进行革兰氏染色[8]，并进行糖发酵试验、V-P试验、甲基红试验、淀粉水解试验、纤维素实验及耐盐实验[8-9]。

1.2.3 菌株的分子生物学鉴定 运用试剂盒提取分离菌的DNA并进行PCR扩增[6,10]。扩增后的16S rDNA进行琼脂糖电泳检测后由上海生工生物工程公司测序，将测得的序列提交NCBI数据库进行序列比对，确定该菌的分类地位[9]。

1.2.4 构建16S rDNA 系统发育树 将测序的结果提交到NCBI数据库中进行序列同源性分析及多序列比较，构建16S rDNA 系统发育树[6]。

1.2.5 分离菌解脂能力测定 用碱滴定法测定菌株的脂肪酶活力[11]。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及生理生化实验鉴定结果

菌落光滑呈圆形，湿润，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，不透明，乳白色，大小约2mm。菌株为杆菌切为弧菌，菌体较小，100倍镜下基本看不见鞭毛芽孢等微小结构。革兰氏染色呈现紫色，糖发酵试验、V-P试验等实验结果见表1。

表1 菌体生化鉴定结果

根据以上实验结果，结合《常见细菌系统鉴定手册》[7]及《伯杰细菌鉴定手册》[9]，初步鉴定该分离菌为芽胞杆菌属。

2.2 菌株分子生物学鉴定结果

扩增片段经测序，测得其长度为1450bp。序列提交到NCBI数据库进行Blast比对，结果显示该菌株与蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus同源性达到99%。据此，可以判断该分离菌为蜡样芽胞杆菌。

2.3 构建系统进化树

选取16株Bacillus的其它菌株基因序列进行多序列比对，并构建同源进化树，如图1所示。

图1 芽胞杆菌属部分物种系统发育树

2.4 解脂能力测定结果

测定菌株的脂肪酶活力后，得到一株具有良好解脂能力的野生天然油脂分解菌，其酶活力为1.28UmL-1。

3 讨论

本次研究从松树油脂中经富集、分离和筛选得到一株高效油脂分解菌，对其进行形态、生理生化及分子生物学鉴定，最终确定该菌分类学地位为蜡样芽胞杆菌。该菌表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，对酸碱盐的耐受性都很强，由此可知该菌对生存环境的适应性很强，能在较恶劣的环境生存、繁衍。此外，经测定该菌的脂肪酶活力为1.28U/mL，具有良好的解脂能力。 目前国内外关于油脂分解菌的研究不少，现阶段已研究发表的油脂分解菌类主要有葡萄球菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属等[12]，但大多是从废水中提取菌种，很少从油杉等天然物质中提取野生菌种，此类研究相对缺乏，而且相关研究对其菌株的油脂降解能力并未进行具体测试。本文的油脂降解菌是从天然的野生物质中提取得到，并对其解脂能力进行了测试，而且根据特征确定了其分类学地位。大力开发微生物制剂处理污水，在本研究的基础上对该菌的扩大培养做进一步的开发，并对其生长环境进行进一步探索是未来将要完成的内容。