PCR-DGGE法分析酸菜中乳酸菌的多样性

燕平梅，魏爱丽，李润花，李 娜，赵文婧，陈燕飞

（1.太原师范学院 生物系，山西 太原 030619；2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，山西 太原 030619）

酸菜是日常生活中常见的发酵类食品，含有大量的可食用营养成分，浸制的过程能产生天然的植物酵素，具有保持胃肠道正常生理功能的作用[1]，酸菜发酵中乳酸菌起重要的作用[2-6]。酸菜发酵过程中会产生硝酸盐和亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种化学致癌物，医学研究证明，人体摄入的硝酸盐在细菌的作用下，可以还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐可使血液的运氧能力下降，还会形成强致癌物亚硝胺。亚硝酸盐的形成与发酵蔬菜中微生物密切相关[7]，因此，微生物多样性是研究酸菜的焦点。

变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）是将同一种属的不同长度的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段分开[8]，其原理是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开[9-11]。在凝胶成像系统中观察到的条带的荧光强度反映了该菌的丰富度，条带越亮，表示该种菌的数量越多[12]。该技术被广泛应用于各种环境微生态的研究，如高温热泉等[13]。DGGE在国外还被广泛用于食品微生态的研究，鉴定微生物种类，评估食品质量，如益生制品、酸面团、干酪等[14]。

有研究报道，酸菜中含有丰富的细菌和真菌，其中，细菌主要有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、醋酸杆菌（Acetobacter aceti）等，真菌主要为德巴利汉逊酵母（Debaryomyces hansenii），酸菜发酵过程中真菌种类比细菌种类少[4]。刘晓辉等[15-16]采用传统培养方法从酸菜中分离乳酸菌，并鉴定为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）、植物乳杆菌（Lactobacillusplanetarium）和肠膜明串珠菌（Leuconostocmesen teroides）；丛敏等[17]采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结合DGGE技术对发酵第40天的酸菜分析得出，酸菜的主要优势菌群为乳杆菌属，包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳杆菌、棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）等。

本研究以市售散装酸菜SA和袋装酸菜SB、SC为研究对象，采用PCR-DGGE的方法分析酸菜中乳酸菌的多样性，为探究酸菜发酵机理奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

散称酸菜（SA）、广乐牌泡酸菜（SB）、松源牌酸菜（SC）：均购买于太原美特好超市长风店。

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒：索莱宝生物有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺、去离子甲酰、过硫酸铵、尿素（均为分析纯）：美国AMRESCO公司；2×TaqMaster Mix、DH5a感受态细胞：天根生物技术有限公司；引物：由上海生物工程公司合成。

1.2 仪器与设备

TC-96（G）H（b）B Life Touch基因扩增仪：杭州博日科技有限公司；DcodeTM凝胶成像系统、DcodeTM浓度梯度电泳仪：美国Bio-Rad公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 酸菜中食盐及亚硝酸盐含量的测定

食盐含量：采用硝酸银滴定法进行测定[18]；亚硝酸盐含量：按照国标GB/T 5009.33—2008《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法》进行测定[19]。

1.3.2 酸菜汤汁中细菌总DNA的提取

分别取3种酸菜汤汁32 mL，10 000 r/min离心10 min。弃去废液，收集沉淀，用滤纸小心吸干，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取3种酸菜中细菌的总DNA。

1.3.3 PCR扩增

分别以3种酸菜中细菌的总DNA为模板，WBAC1（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG-3′）和 WBAC2（5′-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3′）为引物对细菌的16S rDNA V7-V8基因序列进行PCR扩增。

PCR扩增体系：引物WBAC1和WBAC2各1 μL、模板DNA 1.5 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL，加双蒸水（ddH2O）补充至25 μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃再延伸8 min，最后于4℃保存。

PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.4 变性剂梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶的配方见表1。

表1 变性梯度凝胶的配方Table 1 Formula of denaturing gradient gel

PCR扩增产物经DGGE后，切割回收电泳条带，将其作为模板进行PCR扩增，16S rDNA V7-V8的PCR扩增产物与pGM-T Vector连接，转化至感受态细胞DH5a。挑取阳性克隆子送至上海生物工程公司测定基因序列。

1.3.5 DGGE图谱分析

DGGE条带结构多样性分析：采用Quantity One软件自动分析确定DGGE图谱上每个条带的位置和相对光密度值。DGGE泳道内的电泳条带数量用以计算物种丰富度（R），运用电泳条带相对密度值计算物种均匀度（E）及物种多样性（H）[19]。多样性指数（H）、均匀度指数（E）及丰富度指数（R）的计算公式：

式中：ni为单一条带的峰面积；N为某一泳道所有峰面积；S为某一泳道的总条带数。

2 结果与分析

2.1 食盐含量的测定

3种酸菜食盐及亚硝酸盐含量测定结果见表2。

表2 3种酸菜食盐及亚硝酸盐含量Table 2 Salt and nitrite contents in three kinds of sauerkraut

由表2可知，在3种不同厂家的酸菜中，散装酸菜的食盐含量（0.73 mol/L）显著高于两种袋装酸菜（0.17 mol/L、0.30 mol/L）（P＜0.05）；两种袋装酸菜中食盐含量无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜的亚硝酸盐含量（8.40 mg/kg）显著高于两种袋装酸菜（1.20 mg/kg、1.20 mg/kg）（P＜0.05），是袋装酸菜的7倍。两种袋装酸菜食盐含量无显著差异（P＞0.05）。我国国标规定的酱腌菜中的亚硝酸盐含量应≤20 mg/kg[20]，说明3种酸菜的亚硝酸盐含量均符合国家标准，均可放心食用。

2.2 PCR-DGGE结果

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳分析

对16S rDNA V7-V8片段的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

由图1可知，3种酸菜的16S rDNA V7-V8 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带清晰，纯度高，说明提取的DNA可以用于DGGE分析。

2.2.2 变性剂梯度凝胶电泳分析

由于PCR扩增产物分别是3种酸菜中所有微生物16SrDNA V7-V8片段基因的混合，为了鉴定酸菜中原核微生物多样性，因此，需要使用DGGE技术进行分离，DGGE结果见图2。

图2 PCR扩增产物DGGE结果Fig.2 DGGE results of PCR amplification products

由图2可知，每个酸菜样品中都有不同的条带，酸菜SA有3条电泳带（SA1、SA2、SA3）；酸菜SB有两条电泳带（SB1、SB2）；酸菜SC有3条电泳带（SC1、SC2、SC3）。

采用Quantity One软件对8条电泳带进行分析，经过数据处理得到3种酸菜样品DGGE条带的多样性指数（H）、均匀度指数（E）、丰富度指数（R），结果见表3。

表3 3种酸菜样品DGGE条带的指数分析结果Table 3 Indexes analysis results of DGGE band of three kinds of sauerkraut samples

由表3可知，3种酸菜样品DGGE条带的均匀度指数无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜样品DGGE条带的多样性指数显著大于两种袋装酸菜（P＜0.05），两种袋装酸菜样品DGGE条带的多样性指数无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜样品DGGE条带的丰富度指数显著大于袋装酸菜SB（P＜0.05），与袋装酸菜SC无显著差异（P＞0.05）。结果表明，酸菜的包装影响乳酸菌的多样性和丰富性。

2.2.3 测序结果分析

3种酸菜的DGGE条带数量和迁移率均不同，为了研究酸菜中乳酸菌的种类，回收DGGE结果的每个电泳条带，经克隆、测序后，测序结果与美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank库序列进行比对分析，结果见表4。

表4 发酵酸菜细菌群落的DGGE图谱条带测序结果Table 4 Sequencing results of DGGE band of bacterial community in fermented sauerkraut

由表4可知，散装酸菜SA的3条回收带即SA1、SA2、SA3分别与乳杆菌属（Lactobacillussp.）、非培养细菌（uncultured bacterium）、非培养乳球菌属（unculturedLactococcussp.）的相似度较高，为97%、96%、98%；袋装酸菜SB的两条回收带即SB1、SB2分别与Lactobacillus homohiochii、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）的相似度较高，为98%、98%；袋装酸菜SC的3条回收带即SC1、SC2、SC3分别与寡发酵乳杆菌（Lactobacillus oligofermentans）、Lactobacillus homohiochii、非培养乳杆菌属（unculturedLactobacillussp.）的相似度较高，为96%、95%、97%。结果表明，散装酸菜中非培养微生物含量比袋装酸菜中多，两种袋装酸菜均含有乳杆菌属（Lactobacillussp.）和Lactobacillushomohiochii，散装酸菜与袋装酸菜乳酸菌系不同。

3 结论

采用PCR-DGGE技术对3种酸菜中乳酸菌的多样性进行研究。结果表明，散装酸菜中乳酸菌的多样性指数显著高于袋装酸菜（P＜0.05）。散装酸菜与袋装酸菜乳酸菌系不同，散装酸菜SA中含有Lactobacillussp.、uncultured bacterium、unculturedLactococcussp.；袋装酸菜SB中含有Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus curvatus；袋装酸菜SC中含有Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus homohiochii、unculturedLactobacillussp.，两种袋装酸菜中均存在乳酸杆菌属（Lactobacillussp.）和L.homohiochii。