迷迭香精油对金葡菌感染小鼠的干预作用

刘 倩，曹 硕,2，张 昊,2，沈 红,2*，张永红,2*

(1．北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206； 2.动物类国家级实验教学示范中心(北京农学院)，北京 102206)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)又名油安草，别名艾菊，系唇形科迷迭香属植物，多年生常绿亚灌木[1]，其具有独特的香气。迷迭香是一种同时兼有欣赏价值、香料价值和药用价值等多种价值属性的植物。迷迭香精油是迷迭香次生代谢物质，研究发现，迷迭香精油除了含有香气成分,还含有很多药用成分,如抗菌、抗感染物质、抗氧化物质、调节抗癌物质和天然色素等[2]。多数研究表明，迷迭香精油具有广谱的抗菌性，但是对抗菌性的研究大多数都进行体外试验，很少涉及体内研究。近年来，对于精油治疗功效的体内研究大多是用芳香疗法，有研究表明天王补心丹和迷迭香精油均可改善阿尔兹海默病小鼠的记忆功能,但以二者联合使用效果为佳；迷迭香精油联合天王补心丹对小鼠记忆力有改善作用,可以兴奋中枢神经系统,使其在新异环境中的自发活动和探究行为明显增加；天王补心丹对阿尔兹海默病模型小鼠有一定的不良反应,迷迭香精油可降低天王补心丹对阿尔兹海默病模型小鼠的不良反应[3]。佟棽棽[4]为探索芳香植物的香气成分对神经系统的调节作用，发现迷迭香和柠檬草的精油以及活体香气,具有一定的抗抑郁作用。很少有体内研究涉及迷迭香精油的抗菌作用。本研究首先采用药敏试验确定迷迭香精油的抑菌作用，然后通过感染金黄色葡萄球菌制造小鼠肺炎模型，小鼠经鼻吸入迷迭香精油，检测体重、血常规、脏器指数、组织病理变化、细菌定植率等指标，观察其对肺炎是否有缓解作用，目的探讨迷迭香精油通过嗅觉通路改善肺炎小鼠的可行性，以及迷迭香精油的抗菌作用，为其未来开发应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

6～8周龄健康昆明小鼠，体质量20～22 g，购于中国军事医学科学院实验动物中心【SCXK-(京)2016-0002】。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌29213和链球菌购于中国兽药监察所，MHB培养基与琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司，100%迷迭香精油、100%茶树精油、100%薰衣草精油购于北京奥博星生物技术有限责任公司，小鼠白介素6(IL-6)试剂盒购自湖北伊莱瑞特生物科技有限公司。Leica EG1150石蜡包埋机、Leica RM2235型切片机购于德国Leica公司，WFZ-UV-2000型紫外可见分光光度计购于尤尼柯(上海)仪器有限公司，MEK-7222K五分类血细胞分析仪购于日本NIHON KOHDEN公司。

1.2 方 法

1.2.1 迷迭香精油体外抑菌试验 取200 μL金葡萄球菌菌液加入灭菌的MHB中，过夜摇10 h，然后取适量过夜菌加到新的培养基中摇6 h,分光光度计检测其OD值，根据公式y=1.25x+7.0115(x=OD值)计算菌落数为1×10yCFU/mL，每只鼠攻菌2×109CFU。

将100%纯度的迷迭香精油、茶树精油、薰衣草精油分别进行5倍(取200 μL精油原液和800 μL植物油到1.5 mL离心管，振荡)、10倍(吸500 μL 5倍稀释溶液和500 μL植物油到1.5 mL离心管，振荡)、20倍稀释(吸500 μL 10倍稀释溶液和500 μL植物油到1.5 mL离心管，振荡)。取10 μL精油到纸片上，使各纸片充分浸透药液。

按照文献指导制备MHB固体培养基，采用涂布法将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌液分别涂在不同平皿培养基上，并保证菌液渗透于MHB固体培养基，然后将已含有精油纸片轻放于涂菌后培养皿相应的区域。

1.2.2 迷迭香精油体内抑菌试验 取40只小鼠随机分对照组、感染菌模型组、迷迭香组(每组12只)。将小鼠固定，其余小鼠滴鼻感染(顺着呼吸吸入)金葡菌(2×109CFUs/只)，待小鼠完全吸入菌液后，使其平躺笼中；阴性对照组小鼠则按照同样方法处理，滴鼻给予等体积的PBS。

小鼠感染滴鼻细菌，2 h后开始吸入迷迭香精油。吸入方法：将盛有2 mL精油离心管固定于小鼠玻璃罩中上部，打开离心管迷迭香精油挥发弥漫玻璃罩内，将迷迭香组小鼠置于罩内每天2次，每次小鼠吸入精油30 min，连续7 d。同样方法处理模型组和对照组小鼠，但不吸入任何精油。

所有小鼠感染前(0 d)称重，然后分别于1、3、5、7 d称重，同时每组随机取3只小鼠采血，颈椎脱臼处死，打开腹腔摘取肝肺肾脾脏器，肉眼观察脏器大小及色泽等，拍照及称重。脏器系数=脏器重量/体重。试验结束后取小鼠采血，部分血液制备血清，按照IL-6试剂盒说明进行检测；部分血液用于血细胞分析仪分析小鼠血常规指标。无菌条件取部分肺组织称重，置于灭菌匀浆器内，加2 mL无菌PBS快速匀浆处理，离心取上清匀浆液，将200 μL匀浆液涂布于MHB固体培养基上，37 ℃生化培养箱过夜培养24 h，取出记录培养皿内菌落个数，细菌定植数(CFU/mg)=平板上的菌落数×10/肺脏匀浆质量。取疑似病变肺组织，用4 ℃生理盐水洗净后，滤纸拭干，将肺组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，显微镜下观察肺组织结构。

试验数据以平均数±标准差表示，采用t检验分析比较各组数据，方差不齐时用t’检验，用*和△△表示P<0.05 即差异显著，用**和△△表示P<0.01 即差异极显著。

2 结 果

2.1 迷迭香精油对常见病原菌的抑菌活性分析

抗菌素抑菌效果判定标准：抑菌圈直径>15 mm为最敏感，10～15 mm 为中度敏感， 7～9 mm 为低度敏感，0～7 mm为不敏感[5]。由图1和表1知，迷迭香精油组金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌抑菌圈直径分别为(12.6±1.2)mm、(12.4±2.4) mm和(11.5±0.5)mm(表1)，并且与茶树精油和薰衣草精油相比迷迭香精油原液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌种有较强的抑菌活性(图1)；图2显示迷迭香精油原液抑菌圈最大抑菌效果最好，5倍稀释精油(之前的试验证明植物油对三种菌种无抑菌性)有稍弱的抑菌活性，10倍和20倍稀释精油基本没有抑菌圈。

A.金黄色葡萄球菌；B.大肠杆菌；M.迷迭香；C.茶树；X.薰衣草A. Staphylococcus aureus; B. Escherichia coli; M. rosemary; C. tea tree; X. lavender图1 不同植物精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of different plant essential oils on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

A.金黄色葡萄球菌；B.大肠杆菌；C.链球菌1. 迷迭香原液；2. 5倍稀释；3. 10倍稀释；4. 20倍稀释图2 不同稀释倍数迷迭香精油对不同细菌抑菌效果A. Staphylococcus aureus; B. Escherichia coli; C. streptococci1. rosemary stock solution;2. 5-fold dilution;3. 10-fold dilution;4; 20-fold dilutionFig.2 Antibacterial effect of different dilutions of rosemary oil on different bacteria

Tab.1 Diameter of inhibition circle of three essential oils on bacteria in vitro

菌种迷迭香精油/mm茶树精油/mm薰衣草精油/mm金黄色葡萄球菌12.6±1.2 12±2.3 —大肠杆菌12.4±2.410±1.9 —链球菌11.5±0.510.5±1.5—

2.2 小鼠体征变化

对照组小鼠无异常情况出现，但模型组和迷迭香精油组小鼠在感染细菌后开始表现暴躁喜斗，反应强烈，采食减少及大便干结；小鼠吸嗅迷迭香精油后表现较为温和，进食量增加，尿量增多，体征情况好转至恢复正常。

2.3 迷迭香精油对小鼠体重和脏器指数的影响

图3对照组小鼠平均体重随着饲养时间延长体重逐渐增加；肺炎模型组小鼠体重从第1天逐渐降低，从第3天后体重逐渐升高，与对照组比差异显著；迷迭香组小鼠体重从第1～7天逐渐增加呈上升趋势且高于模型组低于对照组，与模型组相比差异极显著。迷迭香组小鼠肺脏指数从第3天后逐渐低于模型组并接近对照组。

与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比，△P<0.05,△△P<0.01图3 迷迭香精油对金葡菌致肺炎小鼠的体重及肺脏指数影响(*P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group)Fig.3 Effect of rosemary essential oil on body weight and lung index of mice with pneumonia caused by Staphylococcus aureus

2.4 迷迭香精油对小鼠炎性细胞及IL-6的影响

采用血细胞分析仪检测小鼠感染细菌7 d内血液中炎性细胞数量，结果对照组小鼠的白细胞数量从第1天到第7天一直保持相对稳定，模型组小鼠白细胞数逐渐增加并高于显著对照组，迷迭香组小鼠血液白细胞数感染第1天高于对照组但低于模型组，以后逐渐升高从第3天白细胞数大幅度降低，极显著低于模型组(图4)；中性粒细胞数总体趋势和白细胞变化一致，迷迭香组小鼠第3天中性粒细胞数量明显降低，且极显著低于模型组(图4)。图5显示小鼠血清中IL-6含量，对照组小鼠血液IL-6含量一直保持着相对稳定，迷迭香组小鼠第1天血清中IL-6含量略有升高，第3天降低之后一直保持稳定水平，且在第3天和第7天与模型组相比差异显著。

与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比，△P<0.05,△△P<0.01图4 迷迭香精油对小鼠炎性细胞的影响*P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control groupFig.4 Effect of rosemary essential oil on inflammatory cells in mice

与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比图5 迷迭香精油对小鼠血清中IL-6含量的影响Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01Fig.5 Effect of rosemary essential oil on serum IL-6 contents in the mice

2.6 迷迭香精油对小鼠肺组织金葡菌定殖的影响

模型组小鼠感染细菌后1～3 d内每毫克肺组织中金葡菌菌落数较高，第5和7天其菌落数极显著降低；迷迭香组小鼠第1天肺组织中菌落数较高，随后菌落数逐渐降低；对照组小鼠肺组织中细菌数一直保持相对稳定的状态(图6)。

2.7 小鼠肺脏组织病理学变化特征

试验结束打开小鼠腹腔，肉眼观察小鼠感染细菌后肺脏出现肿胀、色泽暗红，肺叶上均有大小不等和形状各异的出血斑，肺脏充血，肺组织出现肿硬块，肺门淋巴结肿大、出血；小鼠连续吸嗅迷迭香精油7 d后，肺脏形态出现明显好转，出血斑逐渐减少，充血减弱呈现出淡粉红色，质地变软，接近阴性对照组小鼠肺组织状态(图7)。肺组织切片HE染色结果见图7，与对照组相比，模型组小鼠感染细菌肺组织有大量充血，组织实变明显，肺泡壁增厚，肺泡组织结构完整性破坏，肺泡腔内可见出血；小鼠吸嗅迷迭香精油后，肺组织充血明显减轻，肺泡间隙炎性细胞浸润减少，肺泡结构完整性逐步恢复。

图6 迷迭香精油对金葡萄定殖小鼠肺脏的影响Fig.6 Effects of Rosemary essential oil on staphylococcus aureus colonizing in the mice lung

图7 小鼠肺脏剖检肉眼观察变化(1×)Fig.7 Visual observation changes of mouse lung biopsy (1×)

图8 显微镜观察HE染色肺组织结构(200×)Fig.8 Microscopic observation of HE staining lung tissues from the mice (200×)

3 讨 论

3.1 迷迭香精油抑菌活性及对小鼠肺组织细菌定殖的影响

Adriana等[6]研究发现迷迭香精油中的1,8-桉叶素可通过破坏大肠杆菌的细胞膜而起到抗菌作用。孔静思[7]应用抑菌扩散法测定和比较了香桃木、薰衣草薄荷、迷迭香精油和残渣水提物的抑菌差异，结果迷迭香精油原液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，其可能与迷迭香精油的主要成分α-蒎烯、樟脑和1,8-桉叶素[8]有关。先前的大多文献研究迷迭香精油的抑菌活性时只针对其本身进行，没有选择其他植物精油进行对照，本试验选择和迷迭香同科属的薰衣草以及不同科属的茶树，结果显示同科属的薰衣草对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌没有抑菌圈表明无抑菌作用，而迷迭香精油相较于茶树精油有明显抑菌圈且大于10 mm，说明表现较高的抑菌活性，并且抑菌效果呈浓度依赖性，试验结果与之前对迷迭香精油研究报道基本一致。肺炎模型组小鼠每毫克肺组织金葡菌菌落数在前3 d相对较高，随着时间的推移其菌落数不断的降低，说明小鼠有一定抵抗能力，但小鼠在吸入迷迭香精油后，小鼠肺部细菌定殖数不断的降低，说明迷迭香精油明显抑制金葡菌定殖。

3.2 迷迭香精油对小鼠肺脏组织结构和脏器指数的影响

有研究显示，迷迭香提取物对胃黏膜具有保护作用，将乙醇通过灌胃的方式进入到大鼠的胃部，迷迭香提取物可以减轻大鼠胃部炎症细胞的渗入。试验结果小鼠感染金葡菌后，早期肺脏结构具有明显的变化，但小鼠连续吸入迷迭香精油7 d后，小鼠肺脏形态出现明显好转，接近对照组小鼠肺组织。

体重是动物试验中一个重要的非特异性观察指标[9],试验动物脏器重量和脏器系数是生物医学研究中常用的重要参考[10]。脏器系数升高和下降可能代表着该器官发生充血、水肿、增生肥大性等变化或者是该器官萎缩、有退行性变化[11]。本试验模型组小鼠体重明显减轻，可能与细菌致小鼠肺炎后活动下降、采食饮水减少等有关；模型组肺脏指数高，小鼠每天吸入迷迭香精油后，脏器指数逐渐降低接近对照组，这可能小鼠体质恢复，采食饮水增多，肺部炎症得到缓解。研究发现，嗅觉对小鼠患病也具有治疗效果，通过鼻子进入体内的迷迭香精油，同时可以进入肺部，迷迭香精油的化学分子在肺部进行气体交换，再通过血液循环系统，达到相应的疗效[12]，其具体的作用机理还不清楚。

3.3 迷迭香精油对细胞因子及炎性细胞的影响

肺炎时致炎因子激活中性粒细胞和单核细胞后可释放一系列细胞因子如非特异性炎症因子IL-6等，促进炎症反应和组织损伤[13-16]。Zobel K[17]和Lee YL[18]研究表明，典型的细菌性感染可导致IL-6较高浓度，IL-6 量反映肺炎患者的疾病严重程度。本试验结果小鼠感染细菌致肺炎后，血液中白细胞和中性粒细胞升高，IL-6含量增加，小鼠处于肺炎应激状态且有炎症反应，但小鼠吸入迷迭香精油后白细胞数下降，IL-6含量降低，说明迷迭香精油缓解小鼠肺部炎症。研究表明，迷迭香提取物降低了诱导炎症发生的相关因子，如髓过氧化物酶、IL1-β、TNF-α等，以及减少白细胞有关[19]。综上所述，迷迭香精油体外对大肠杆菌、链球菌、金葡菌有一定抑制作用，小鼠吸入迷迭香精油对金葡菌感染小鼠致肺炎症状有一定的缓解作用，研究结果为以后植物精油对动物炎症影响的研究提供了良好的方法和试验动物模型。