外源钙和NO对盐胁迫下梨保护酶的影响

李俊豪，解 斌，景淑怡，宋宇琴，李六林

(山西农业大学 园艺学院，山西太谷 030800)

梨是中国主栽果树之一，具有重要经济价值。由于不合理灌溉和施肥等诸多因素，使得土壤次生盐渍化问题不断加剧，土壤盐渍化成为严重影响梨产业正常发展的主要非生物胁迫之一。

在盐胁迫下植物体内会产生大量自由基，从而使植物产生膜质过氧化作用，膜透性增加，导致植物体内稳态被打乱，显著抑制植物的正常生长和发育[1]。植物在长期进化过程中，相应形成了由酶促和非酶促组成的抗氧化防御系统，酶促反应系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等保护酶，以减轻或清除ROS的伤害，从而增强植物对逆境胁迫的耐受或抵抗能力[2]。目前研究认为，利用外源物质例如钙和一氧化氮等对栽培作物进行诱抗处理是提高其逆境耐受性的简便、有效、可行的方法之一[3]。钙是植物必需的一种矿质营养元素，作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联胞外信号，在调控多种酶活性等过程中均具有重要的作用，外源“补钙”可以改变植物生长特性。已有研究表明，外源CaCl2可以缓解盐胁迫[4]、干旱胁迫[5]和病菌侵染[6]等逆境对植物产生的伤害。一氧化氮(NO)也是植物体内一种重要的信号分子，具有调节植物生长发育、参与植物应答各种逆境胁迫的生理功能。周万海等人[7]研究发现外源SNP处理能明显缓解盐胁迫对苜蓿幼苗根系生长的抑制，李翠芳等[8]研究表明外源SNP能增强叶片抗氧化能力，改善叶质。因此，研究盐胁迫下外源SNP及CaCl2对梨愈伤组织的保护酶系统的调控作用，对于深入理解梨在生长过程中抵抗逆境、减少活性氧积累的机制具有十分重要的意义。

组织培养具有实现植物遗传背景一致，生长环境可控的优势。因此，试验以组织培养杜梨和雪花梨愈伤组织为材料，研究两者保护酶系统在响应NaCl胁迫时的变化差异，同时使用外源CaCl2和NO处理，测定雪花梨在NaCl胁迫下保护酶的活性变化情况，以期明确CaCl2和NO在提高梨抗盐性过程中的调控机制，为外源钙和硝普钠(SNP)在逆境缓解效应中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为杜梨和雪花梨茎段愈伤组织。梨茎段于2017年5月采自山西省农科院果树研究所梨资源圃，并在山西农业大学园艺学院进行愈伤组织培养。

1.2 试验设计

选择生长旺盛且均匀一致的杜梨和雪花梨愈伤组织，分别接种于含100 mmol/L NaCl[9]的MS培养基中，每个处理接种30瓶。在NaCl处理的雪花梨愈伤组织培养瓶中，分别外施10 mmol/L CaCl2和一氧化氮供体100 μmol/L硝普钠(SNP)，每个处理接种30瓶，分别于处理的0、6、12和24 h随机采样0.2 g，液氮速冻，保存于零下80 ℃的冰箱中备用。

1.3 测定项目及方法

酶液制备参照安玉艳[10]等的方法，并略作修改：取保存的愈伤组织，液氮研磨，加1.6 mL预冷的提取液(50 mmol/L，pH 7.8 磷酸缓冲液)，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min，上清液即为酶提取液，于4 ℃冰箱中保存备用。

超氧化物歧化酶活性：氮蓝四唑光还原法测定；过氧化物酶活性：愈创木酚显色法；过氧化氢酶采用紫外线吸收法测定，具体参照高俊凤[11]的实验方法；抗坏血酸过氧化物酶活性参照邹琦等[12]的方法进行。每个指标重复测定3次，取平均值。

使用Microsoft Excel 2013 软件进行数据处理和作图，使用SAS 9.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对超氧化物歧化酶活性的影响

SOD是植物体内清除超氧自由基的关键酶类，可催化O2-生成H2O2和O2[13]。由图1-A可知，在NaCl处理下，杜梨愈伤组织SOD酶活性呈先升高后降低的趋势，在处理6 h时达到峰值，约为对照的1.5倍；雪花梨愈伤组织的SOD酶活性随着NaCl胁迫时间的延长则呈降低趋势，且均低于对照，在处理24 h时为对照的0.83倍，差异达显著水平(P<0.05)。

如图1-A所示，在NaCl处理的同时施以CaCl2和SNP，对雪花梨愈伤组织SOD酶活性影响显著。外源CaCl2和SNP均能改变SOD酶活性降低的趋势，但呈现出不同的变化特征。在CaCl2处理组中，雪花梨愈伤组织SOD酶活性呈缓慢上升趋势，在24 h达到峰值，约为单独NaCl处理的1.22倍。在SNP处理组中，雪花梨愈伤组织SOD酶活性呈先升高后降低的趋势，且在6 h时酶活即达到峰值，约为单独NaCl处理的1.17倍。

通过上述结果可以看出，在NaCl胁迫下，CaCl2处理和SNP处理均能提高SOD酶活性，与单独NaCl处理相比，差异显著。而与CaCl2处理相比，SNP处理能更快激活SOD的酶活性，且酶活更高。说明在NaCl胁迫下，经过适当的钙和SNP处理能使SOD酶的活性增加，进而增强雪花梨对NaCl胁迫的耐受性。

2.2 不同处理对过氧化物酶活性的影响

POD是膜脂过氧化防御系统的主要保护酶，通常用以反映植物抗盐性强弱[14]。如图1-B所示，在NaCl处理24 h内，杜梨愈伤组织POD酶活性有显著提高(P<0.05)，且其最大酶活在处理12 h时出现，约为对照处理的2.29倍；随着NaCl胁迫时间的延长，雪花梨愈伤组织POD酶活性呈降低趋势，且均显著低于对照(P<0.05)，在处理12 h时降至对照的0.38倍。表明在NaCl胁迫下，杜梨愈伤组织POD酶能在抗氧化酶系统中起到积极作用，而雪花梨愈伤组织POD酶受到一定程度破坏。

在NaCl处理的同时施以CaCl2和SNP，对雪花梨愈伤组织POD酶活性同样影响显著(图1-B)。在CaCl2处理组中，雪花梨愈伤组织POD酶活性被快速激活，在处理6 h时达到峰值，为对照处理的1.35倍，为单独NaCl处理6 h时POD酶活的1.97倍，且在处理12 h和24 h时均降低至对照水平，其与CaCl2处理下的SOD酶活相比，表现更为活跃。在SNP处理组中，雪花梨愈伤组织POD酶活性也在处理6 h时出现峰值，约为对照处理的1.33倍。

分析上述结果可以看出，与单独NaCl处理相比，外施CaCl2和SNP可以使POD酶活性峰值出现时间提前，均出现在处理后6 h内。表明在NaCl胁迫下，两种外源物质处理均可提高POD酶的活性，以此帮助雪花梨尽快适应高盐环境。

CK表示未经NaCl处理的样本，6、12、24 h表示NaCl处理对应时间的样本；不同小写字母表示在5%水平上差异显著(P<0.05)，图2同图1 NaCl胁迫下钙和一氧化氮对梨愈伤组织SOD酶和POD酶活性的影响Note:CK indicates the samples without NaCl treatment in the figure,6 h,12 h and 24 h indicate the samples with NaCl treatment corresponding treated time; and different lowercase letters show significant difference at 5% level (P < 0.05), the other figures are as same.Fig.1 Effect of calcium and nitric oxide on superoxide dismutase activity andperoxidaseactivity in pear callus under NaCl stress

2.3 不同处理对过氧化氢酶活性的影响

CAT主要存在于乙醛酸循环体、线粒体和过氧化物体中，是催化并清除H2O2的重要酶类[15]。NaCl处理下杜梨和雪花梨愈伤组织过氧化氢酶活性的变化规律如图2-A所示。在NaCl处理下，杜梨CAT酶活性在处理6 h时出现大幅下降，之后显著升高(P<0.05)，其中在NaCl处理12 h时杜梨愈伤组织CAT酶活性显著高于对照组和NaCl处理6 h时的酶活性(P<0.05)，分别是2.10倍和5.19倍；在处理24 h时，CAT酶活虽出现下降，但仍显著高于对照组和处理6 h时的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈伤组织CAT酶活性变化趋势表现出与杜梨类似的趋势，在NaCl处理12 h和24 h时，雪花梨愈伤组织CAT酶活性均显著高于处理6 h时的酶活性，分别达3.22倍和2.52倍，但与对照处理酶活性相比，差异均未达显著水平(P>0.05)。

在NaCl胁迫条件下，施加CaCl2和SNP的雪花梨愈伤组织与未施加的相比，其CAT酶活性变化存在显著差异(P<0.05)(图2-A)。结果显示，在外源CaCl2和SNP处理下，雪花梨愈伤组织CAT酶活性被快速激活，在处理6 h时达到峰值，分别为对照处理的1.61倍和1.89倍，另外，分别也为单独NaCl处理的4.72倍和5.76倍，随后酶活性呈下降趋势。CAT酶活性在经钙和一氧化氮处理后发生明显改变，表明两种外源物质对雪花梨愈伤组织的CAT酶活性起到明显促进作用。

图2 NaCl胁迫下钙和一氧化氮对梨愈伤组织CAT酶和APX酶活性的影响Fig.2 Effect of calcium and nitric oxide on catalase activity and ascorbate peroxidase activity in pear callus under NaCl stress

2.4 不同处理对抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

APX是抗氧化系统的关键解毒酶，能够将H2O2分解为H2O。如图2-B所示，经NaCl处理不同时间后，杜梨和雪花梨愈伤组织APX酶活性变化规律存在显著差异。在NaCl处理下，杜梨APX酶活性在处理6 h时未有明显增加，在处理12 h时杜梨愈伤组织APX酶活性显著高于对照组和处理6 h时的酶活性(P<0.05)，分别是3.51倍和2.55倍，在处理24 h时，APX酶活虽出现下降，但仍显著高于对照组和处理6 h时的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈伤组织APX酶活性变化趋势与其SOD酶活性变化一致，在NaCl处理24 h内，雪花梨愈伤组织APX酶活性显著低于对照处理的APX酶活性(P<0.05)。以上结果说明，APX酶在耐盐性杜梨适应盐胁迫的过程中发挥积极作用。

雪花梨愈伤组织在NaCl处理的同时施以CaCl2和SNP与单独NaCl处理相比，其APX酶活性随处理时间延长变化趋势存在差异(图2-B)。结果显示，外源CaCl2和SNP虽均未改变NaCl胁迫下雪花梨愈伤组织APX酶活性的下降趋势，但减缓了下降的幅度。在施加CaCl2处理中，NaCl处理6 h时的APX酶活性与对照差异不显著(P>0.05)，但为单独NaCl处理的1.72倍；CaCl2处理12 h时的APX酶活性为不加CaCl2的4.9倍。在施加SNP处理6 h和12 h时的酶活性分别为单独NaCl处理1.29倍和2.87倍。以上结果证实了在应对高盐环境时，外源钙和一氧化氮对雪花梨所受损伤的缓解作用。

3 讨论与结论

在逆境环境下，需氧生物活性氧代谢失调引起的自由基积累及自由基对大分子的破坏是植物组织遭受伤害的重要特征。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶等是植物评价抗性的重要指标[16]。马丽清等[17]对苹果砧木的研究中发现，在盐胁迫条件下，耐盐种珠美海棠膜保护酶系统活性较高。研究结果显示，杜梨愈伤组织在NaCl胁迫下，具有更加活跃的保护酶系统，而雪花梨的各类保护酶出现了不同程度的下降，说明与雪花梨愈伤组织相比，杜梨愈伤组织具有更强的自我保护机制，以抵抗盐生环境的伤害。

Ca2+是一种良好的生物膜保护剂，可以提高抗氧化酶活性，增强清除活性氧自由基的能力；NO作为一种信号分子可以激活抗氧化酶基因表达，能调节植物对逆境胁迫的适应及反应，促进植物的防卫反应，增强抗逆性[18]。王策等[19]研究表明，10 mM CaCl2处理可通过促进NaCl胁迫下酸枣幼苗植株体内抗氧化酶活性的提高，增强植株对NaCl胁迫的适应性。王延秀等[20]研究表明，SNP处理能够激活水分胁迫下楸子幼苗的抗氧化酶系统，增强其耐旱性。研究结果发现，外源CaCl2和SNP的施用，虽对APX酶活性的影响不显著，但可以有效提高盐胁迫下雪花梨愈伤组织SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，对缓解盐胁迫影响、促进植株正常生长发育有重要作用。从酶活变化趋势看，在外源SNP处理下，NaCl胁迫下雪花梨愈伤组织SOD、POD和CAT均在处理6 h时显著上升，之后下降；在外源CaCl2处理下，NaCl胁迫下雪花梨愈伤组织SOD呈逐渐上升趋势，而POD和CAT变化波动较大。说明两种外源物质分别参与不同的抗氧化酶调控机制，缓解盐胁迫伤害。这一结果可能与钙和一氧化氮在植物体内所发挥的信号作用密切相关，而具体作用机制有待进一步证实。