Matrigel三维培养模型对乳腺癌细胞整合素β1的定位及胞外基质粘附的影响*

辜翠容，刘惠芬，王浩，黄灵潇，黄建鸣，米坤

随着对肿瘤微环境的认识深入，越来越多的研究表明肿瘤恶性进展与肿瘤微环境密切相关[1-4]，整合素也参与其中[5-7]。整合素是一类关键分子，可介导细胞与ECM间的连接，使细胞在基因表达及行为等多方面发生改变。采用接近体内微环境的培养模型对肿瘤微环境研究非常重要。Matrigel 3D培养模型已经广泛用于生物医学研究的诸多领域[8-9]。3D培养模型既能较好地模拟体内细胞微环境的物质基础及空间结构, 又具备细胞培养的直观性和可控性，细胞的基因表达模式及其生命活动更接近于生命有机体[10]。研究显示整合素β1在细胞表面的重新分布与肿瘤细胞之间粘附能力的改变，并与侵袭迁移过程中肿瘤细胞粘附ECM能力的变化密切相关[11-12]。当整合素β1与不同的α整合素亚基配对结合构成整合素分子时，可与其配体层粘连蛋白、纤连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等结合，调节多种细胞功能及肿瘤细胞的侵袭转移[13-16]。本实验通过研究2D及Matrigel 3D培养模型中乳腺癌细胞表面整合素β1的定位及其介导的细胞与ECM蛋白的粘附能力，揭示乳腺癌细胞在模拟体内3D微环境的情况下与胞外微环境的相互作用，为研究乳腺癌细胞侵袭转移过程及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

本研究所用的细胞系为人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S及MDA-MB-231，购于中国科学院上海细胞生物学研究所。1640培养基、胎牛血清、双抗、0.25% Trypsin-EDTA购自Invitrogen公司；Matrigel、超纯层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、纤连蛋白购自BD Biosciences公司；整合素β1抗体购自Cell signaling公司；DAPI及钙黄绿素(Calcein AM)购自Molecular Probes公司。

1.2 细胞培养

1.2.1 2D细胞培养 完全培养基使用含10%胎牛血清的1640培养基，将细胞接种后置于37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养, 至80%～90%融合度时胰酶消化传代。

1.2.2 3D细胞培养 4℃溶解Matrigel母液。消化细胞，重悬至完全培养基中，计数，细胞培养终浓度为5×105/mL。使用时置于冰上，用预冷的细胞重悬液与Matrigel等体积混匀，24孔板中每孔加入100μL。37℃放置30min使其成胶，添加完全培养液。置于37℃细胞培养箱中孵育，第二日换液后隔日换液一次。

1.3 细胞存活力的检测

采用钙黄绿素Calcein AM检测细胞胞内普遍存在的酯酶活性来分析细胞存活力。预冷PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次15min，以去除或稀释血清中的酯酶活性。将2μM的Calcein AM工作液添加至3D细胞培养基质中，室温孵育45min。倒置荧光显微镜下观察。

1.4 免疫荧光染色

细胞经4%多聚甲醛固定后PBS洗涤，加入blocking 溶液，室温下孵育2h。IF buffer稀释整合素β1一抗溶液加入细胞中4℃孵育过夜。IF buffer室温下洗涤3次后加入二抗工作液孵育60min。PBS洗涤后添加300nM的DAPI工作液，室温下孵育5min。PBS洗涤3次后荧光显微镜下观察并采图。

1.5 细胞粘附率的研究

96孔板每孔中分别添加50μg/mL的纤粘蛋白，层粘连蛋白和IV型胶原，室温下干燥。收集100～150 个2D培养细胞及3D细胞克隆于100μL无血清的培养基中，添加至孔板后37°C孵育4小时。各孔细胞总数在显微镜下计数，随后用PBS洗涤3次以去除未粘附的细胞，显微镜下计数粘附细胞，计算粘附率[17]。

1.6 统计学分析

数据的统计分析使用SPSS进行，统计学处理采用标准差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生长在三维Matrigel基质中的乳腺癌细胞形貌结果

图1为乳腺癌细胞MDA-MB-435S及MDA-MB-231生长在3D Matrigel基质中的明场图。在3D Matrigel基质中的细胞生长呈现出球形的克隆，且随着培养时间的增加，细胞克隆逐渐增大。通过培养3天、 5天及7天后的形貌图可明显分辨，在Matrigel中，MDA-MB-435S细胞逐渐形成了多细胞的球形细胞克隆，MDA-MB-231细胞在培养7天后细胞克隆之间形成触手状连接，提示3D培养的建立使得乳腺癌细胞在胞外基质微环境中形成了具有3D空间结构的多细胞群。

2.2 3D Matrigel培养模型中细胞的活性分析

活细胞内的酯酶可将无荧光的Calcein AM 转化为强绿色荧光的Calcein。从图2中可以看出，细胞在Matrigel基质中的存活力好，细胞与Matrigel材料具有较好的生物相容性，3D Matrigel培养模型可模拟肿瘤细胞外微环境用于后续研究。

图1 乳腺癌MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞在3D Matrigel中培养3、5、7日时的明场图

Figure 1. MDA-MB-435S and MDA-MB-231 Cultured in 3D Matrigel at the Third, Fifth and Seventh Day Respectively

图2 MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞在3D Matrigel中的细胞存活荧光图(bar=500μm)

Figure 2. Encapsulation of Cells in 3D Matrigel Using Calcein-AM Staining for the Living Cells(bar=500μm)

2.3 生长在3D Matrigel基质中的乳腺癌细胞整合素β1的表达定位结果

本实验对Matrigel 3D培养模型中5d时期形成的细胞球形克隆进行整合素β1的免疫荧光检测，分析其在细胞克隆中的表达定位。培养在传统的组织培养瓶的细胞并不能展现体内3D空间中细胞的整合素表达，而是在2D模式下，平铺的细胞膜表面弥散性地表达整合素β1(图3)，无法呈现3D空间结构下的细胞与细胞之间的相互作用。整合素β1在体内正常上皮细胞的基底外侧表面特异性地表达，而在肿瘤细胞中错误定位并且表达增高[18]。我们在乳腺癌细胞的3D Matrigel培养模型中观察到，多细胞克隆中整合素β1高表达于细胞与细胞之间，细胞与微环境的ECM之间(图4)，与2D培养贴壁生长的伸展形式细胞上整合素β1的分布(图3)形成显著差异，这使其可介导并稳定细胞与ECM间的连接，进而作为ECM的受体，在细胞粘附发生时激活胞内信号转导途径，引起细胞在基因表达及行为等多方面发生效应。

图3 2D培养模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞中整合素β1(绿色)及细胞核(蓝色)的免疫荧光图(bar=50μm)

Figure 3. Immunofluorescence Characterization of Integrin β1 (Green) with DAPI Stained Nuclear (Blue) in Cells in 2D Culture Model(bar=50μm)

图4 3D Matrigel培养模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞中整合素β1(绿色)及细胞核(蓝色)的免疫荧光图(bar=50μm)

Figure 4. Immunofluorescence Characterization of Integrin β1 (Green) with DAPI Stained Nuclear (Blue) in Cells in 3D Matrigel Culture Model(bar=50μm)

2.4 细胞对ECM蛋白的粘附率结果

MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞于2D培养及3D Matrigel基质中培养的细胞或细胞克隆对不同的ECM蛋白包括层粘连蛋白(laminin)，纤粘蛋白(fibronectin)及IV型胶原(collagen IV)的粘附率出现显著性差异，结果如图5所示。与2D细胞相比较，3D培养的细胞克隆对层粘连蛋白的粘附率明显下降，而对纤粘蛋白和IV型胶原的粘附率均呈现上升，且具有统计学上的显著性差异(P<0.05)。粘附率的差异结果表明，在2D及3D的不同培养条件下，细胞与ECM的相互作用存在显著性差异，这与3D培养基质微环境中乳腺癌细胞整合素β1的表达及其定位直接相关，也是肿瘤微环境影响细胞行为的又一有力证明。

图5 2D与3D不同培养模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞与ECM蛋白的粘附率结果(P<0.05)

Figure 5. Adhesion Ability of of MDA-MB-435S and MDA-MB-231 to ECM Proteins in 2D and 3D Culture Models(P<0.05)

3 讨 论

细胞在2D环境下进行培养有若干重大的缺点[19]：第一，2D 培养无法建立一个真正的化学信号的3D 梯度；第二，从有机体直接分离下来的细胞在 2D 培养中会频繁地改变新陈代谢及基因的表达模式；第三，细胞在 2D 环境中生长可显著改变ECM蛋白的表达并导致形态学的变化，细胞表面的受体如整合素等不能正确地聚集定位，影响了细胞间的交流。体内微环境是一个立体的3D组织微环境，细胞对微环境的应答方式对细胞行为具有关键指导作用，涉及细胞与细胞之间，细胞与胞外基质之间的一系列复杂的相互作用。3D细胞培养结果揭示，生长在3D环境中的细胞，其基因表达模式和一系列生物学活动更接近生命有机体。肿瘤微环境包括肿瘤细胞本身，细胞外基质以及细胞因子等，体外构建肿瘤微环境需选择合适的细胞外基质。许多研究中使用的3D培养支架为带有微米级孔隙的合成聚合物，如直径为微米级别的聚乳酸/羟基乙酸共聚物等形成的支架材料等。而类似于生物组织的纳米孔隙结构才是真正接近于体内环境的材料，包括Ⅰ型鼠尾胶原和Matrigel基质等水凝胶类基质已被诸多研究者用作3D细胞培养基质。Matrigel是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物, 可在室温下成水凝胶并形成重组基膜，是理想的肿瘤细胞3D基质培养材料之一，我们的实验选择了Matrigel基质构建乳腺癌细胞3D培养模型，在Matrigel水凝胶基质中细胞成3D生长方式，形成更接近体内肿瘤组织的3D结构，可用于研究整合素β1的定位及胞外基质粘附的影响，并可在肿瘤发生发展、信号通路及药物筛选等进行下一步深入的研究。

越来越多的证据表明，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞及其微环境的一系列相互作用的结果。肿瘤微环境的成分及功能大部分尚不明确，但ECM与其密切相关。ECM是由胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、蛋白多糖、透明质烷及硫酸类肝素蛋白多糖构成的细胞外环境。ECM在发展模式，组织构建以及细胞微环境上发挥了关键性的角色。在肿瘤的侵袭转移过程中，肿瘤细胞与ECM发生粘附并附着是转移的第一步，整合素β1可通过与ECM蛋白如层粘连蛋白，纤粘蛋白及IV型胶原等结合，提高肿瘤细胞的迁移能力[20]。最新研究证实整合素β1也是肿瘤侵袭转移及药物耐受的关键调节子[21-22]，可作为重要的生物标记用于三阴乳腺癌的诊断中[23]。整合素β1作为一种重要的细胞粘附分子受体，在更接近于体内微环境的3D模型中对其作用机制进行研究已成为突破点之一。目前，3D模型研究肿瘤微环境与整合素β1，及其与侵袭转移的关系在国内外均处于起步阶段。本研究首次在肿瘤细胞3D模型中将整合素β1的表达定位与ECM蛋白的相关性进行研究，旨在探讨模拟体内微环境的细胞培养模式下，乳腺癌细胞整合素β1与胞外微环境的联系，为肿瘤细胞学研究提供一种新的研究模式与方法。肿瘤微环境与肿瘤侵袭转移的关系，侵袭转移过程中微环境ECM与肿瘤细胞的相互作用有待进一步明确。通过胞外微环境与整合素β1的相关研究将有助于对肿瘤发生发展过程中的各个环节有进一步的理解，对肿瘤侵袭转移、耐药性及信号通路的研究乃至肿瘤的治疗起到相应的指导作用。

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