CD68+肿瘤相关巨噬细胞在结直肠癌中的表达与预后的关系*

王毅钧， 李瑞平， 李力波， 陈实， 张玉奇， 李小悦△

1东莞市人民医院胃肠外科(广东东莞 523059)； 2中山大学附属第六医院胃肠外科(广东广州 510655)； 3桂林医学院第二附属医院急诊科(广西桂林 541000)

结直肠癌中不仅包含恶性肿瘤细胞，还包含许多其他非恶性细胞类型如成纤维细胞、内皮细胞和各种浸润免疫细胞[1]。此外，对于目前结直肠癌的TNM分型方法并未能充分反映结直肠癌的肿瘤生物学行为和患者预后[2]。因此，确定生物标志物以预测肿瘤发展和进展具有重要意义。目前多项研究[3-4]表明，免疫细胞浸润可以显著影响病程的进展和预后。其中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)通常构成浸润免疫的重要组成部分细胞，TAMs是参与肿瘤微环境和炎症的重要组成部分，其起源于循环单核细胞，并通过招募到肿瘤组织中。同时，不同的微环境可能导致两种不同的极化TAMs：经典激活型M1表型和可选激活的M2表型[5]。M1巨噬细胞被认为是促进炎症反应和抗肿瘤活性。M2巨噬细胞主要是参与抗炎反应，组织重塑，血管生成和肿瘤细胞活化。虽然TAMs在肿瘤微环境中的作用及其预后价值已经被表明具有明确的相关性，但在不同的肿瘤中对预后具有不同的影响。如在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、胃癌和头颈部肿瘤中[8]，TAMs密度高的患者预后不良。但是，既往的研究表明，癌组织中TAMs密度高的结直肠癌患者具有更好的预后[9]。因此目前对于TAMs在结直肠癌组织中与临床特征的关系及对预后的影响仍然具有争议[10-13]，本研究旨在进一步明确TAMs与结直肠癌患者临床特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月至2016年3月于我院行手术治疗的结直肠癌患者的肿瘤组织和癌旁组织标本共120例，纳入标准：(1)经病理确诊为结直肠癌；(2)行手术治疗的患者；(3)病历资料完整的患者；排除不能获得完整随访的患者；本研究经医院伦理委员会审核并批准。120例结直肠癌患者中均选择其癌组织作为观察组，选择癌旁组织作为对照。纳入的120例患者中，男74例，女46例，年龄33～87岁，平均(56.4±12.8)岁。其中肿瘤位于结肠共65例，位于直肠55例，TNM分期为Ⅰ～Ⅳ期。

1.2 病理学检查 所有手术组织均由本院病理科处理，将来自甲醛溶液固定标本的石蜡块切成5 μm并用于免疫组织化学检测，采用苏木素和伊红染色切片对肿瘤进行分级。

免疫组化方法：将5 μm厚的组织切片在56℃下烘烤1 h，然后在二甲苯中脱蜡两次，每次10 min，并在不同浓度乙醇中再水化。然后将切片在蒸馏水中冲洗并在10%蔗糖中浸泡过夜。通过在柠檬酸盐缓冲液中煮沸30 min来进行抗原提取。冷却15 min后，将载玻片在pH 7.4的PBS中漂洗，在1.2%过氧化氢的甲醇溶液中温育30 min，并在pH 7.4的PBS中冲洗15 min。然后用正常山羊血清(C0256，碧云天)将切片封闭30 min。在4℃下与兔单克隆抗人CD68抗体(#76437，CST)孵育过夜后，将载玻片在pH 7.4的PBS中洗涤3次，每次5 min，并与生物素标记的二抗于37℃条件下孵育1 h,在pH 7.4的PBS中冲洗，然后在pH 7.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液中冲洗10 min。通过使用在15 mL 0.05 Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和二氨基联苯胺(DAB)室温反应2～10 min，并对切片用苏木精复染，放置后以进行光学显微镜检查。

1.3 CD68+TAMs的评估 每张切片中选择5个最多CD68+TAMs浸润最多的视野，计算在高倍镜视野下(×200)肿瘤组织及CD68+TAMs数目。具体图像计数采用Image J软件进行，取5个视野中的平均CD68+TAMs数目；在120例肿瘤组织中，取中位数为每个视野>60个CD68+TAMs为高表达，≤60个CD68+TAMs为低表达。

1.4 患者资料的收集 记录所有患者的年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期，区域淋巴和远处结转移的情况，记录患者病理检查的分化程度和组织学分级，所有患者在术后1、3、6个月返院复诊，6个月后每半年返院复诊，记录患者随访的生存期和无病生存期。

2 结果

2.1 CD68+TAMs在结直肠癌组织和癌旁组织的浸润情况 120例结直肠癌患者中的平均肿瘤组织CD68+TAMs浸润数为(64.3±26.8)个/高倍镜，而癌旁组织平均肿瘤组织CD68+TAMs浸润数为(21.5±11.7)个/高倍镜，肿瘤组织CD68+TAMs浸润细胞数显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=16.033,P<0.001)。

2.2 CD68+TAMs在结直肠癌组织中的表达与临床特征的关系 结直肠癌组织中CD68+TAMs细胞密度与临床特征的关系中，其TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、区域淋巴结没有转移、没有远处转移和病理分级为Ⅰ～Ⅱ患者的CD68+TAMs高表达比例显著高于CD68+TAMs低表达的比例(P<0.05)，而CD68+TAMs的表达在不同性别比例、年龄、肿瘤位置、浸润深度、分化程度中的比例对比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1和表1。

A：CD68+TAMs在结直肠癌组织的浸润情况；B：CD68+TAMs在结直肠癌组织的浸润情况(低表达)；C：CD68+TAMs在结直肠癌组织的浸润情况(高表达)

图1 CD68+TAMs在结直肠癌组织和癌旁组织的浸润情况(×200)

2.3 CD68+TAMs在结直肠癌组织中的表达与预后的关系 120例患者随访时间为3～46个月，中位随访时间为36个月，其中62例癌组织CD68+TAMs高表达的患者中，CD68+TAMs高表达患者的总体生存率(OS)为79.0%，CD68+TAMs低表达的OS为60.3%，Kaplan-Meier生存曲线结果显示CD68+TAMs高表达患者的OS和无病生存率(DFS)显著优于CD68+TAMs低表达的患者，差异有统计学意义(OS：HR=0.429，95%CI：0.221～0.834，P=0.013； DFS：HR=0.424，95%CI：0.230～0.782，P=0.006)。见图2。

3 讨论

在肿瘤组织中，除了与肿瘤发生和进展有关的遗传和(或)获得性遗传因素之外，微环境对于肿瘤细胞行为，侵袭性和转移也具有重要意义[12]。微环境因素包括肿瘤浸润免疫细胞，包括TAMs，其一般构成肿瘤基质的主要成分。作为肿瘤微环境的一部分，TAMs对肿瘤进展具有重要的作用。既往研究[13]表明，TAMs对肿瘤具有促进和抑制两种作用，TAMs被认为在调节癌症进展和肿瘤生长中发挥复杂作用并且影响患者的预后、生存和转归，包括结直肠癌患者的预后[14]。在本研究中，我们观察到结直肠癌组织中的CD68+TAMs表达水平显著高于正常组织，且CD68+TAMs与临床和病理特征包括TNM分期、区域淋巴结转移、远处转移和病理分级具有密切关系。上述临床病理特征通常与更具侵袭性的肿瘤表型和更差的患者预后相关。此外，在我们的结直肠患者队列中，肿瘤组织的CD68+TAMs的高密度表达水平显示了更高的OS和DFS，表明了在结直肠癌中CD68+TAMs是有利的预后因子。

表1 CD68+ TAMs在结直肠癌组织中的表达与临床特征的关系 例(%)

本研究结果与既往CD68+TAMs在结直肠癌组表达的预后情况结果相一致。据Gulubova等[15]通过210例结直肠癌患者的肿瘤组织免疫组化结果发现，肿瘤组织中低密度的CD68+TAMs是结直肠癌患者预后的不良因素。还有报道[16]称，限制性结直肠癌中基质CD163巨噬细胞的增加以及CD163阳性巨噬细胞浸润增加的趋势是更好的存活。但对于不同肿瘤中TAMs对临床特征和预后的结果存在显著的差异。既往的荟萃分析[11]结果显示，高密度的TAMs在胃癌患者泌尿生殖系统肿瘤和头颈部肿瘤患者显示出更差的总体生存率。因此，在评价TAMs的作用在不同的肿瘤组织中存在差异时，为何在结直肠癌中更多富集CD68+TAMs 则显示出良好的预后，其具体的机制仍值得深入探讨。

A:OS;B:DFS

由于结直肠癌中浸润最多的为CD68+巨噬细胞，巨噬细胞代表了作为先天免疫抵御外来病原体的第防一线，巨噬细胞也可以通过肿瘤细胞和非肿瘤发生细胞区分肿瘤细胞特异性细胞膜的蛋白并随后清除恶性细胞。TAM在抗肿瘤M1和促肿瘤M2之间的平衡中动态地转移表型[17]。因此，在高表达的CD68+TAMs中，可能存在更多的肿瘤M1表型的TAMs。到目前为止，肿瘤微环境中的一些因子已经被证明与TAMs的招募和调控分化密切相关。这些刺激物包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的CSF-1，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，趋化细胞因子配体2(CCL2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)[18]，还有多种细胞因子如TNF-α、IL-4、IL-13、IL-10、IL-33、IL-25、TGF-β等[19]。因此，对于具体不同个体和结直肠癌组织中，是否存在特异的生物标记物调控TAMs的具体表型仍值得进一步深入研究。

综上所述，结直肠癌组织较正常结肠组织中CD68+TAMs细胞数显著增多，且癌组织CD68+TAMs与肿瘤分期、病理分级、淋巴结及远处转移密切相关，高CD68+TAMs表达患者具有更好的临床预后。