恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清和肝组织可溶性纤维蛋白原样蛋白2水平的变化*

谷孙泽栋，杨晓飞，张佩欣

纤维蛋白原样蛋白2（fibrinogen-like protein2，FGL2）属于纤维蛋白原相关蛋白超家族，亦称FGL2凝血酶原酶，有两种类型，即膜型FGL2（membrane FGL2，mFGL2）和可溶性 FGL2 （soluble FGL2，sFGL2）。sFGL2主要由调节性T淋巴细胞（regulatory T cells，Treg）分泌，具有免疫调节作用，可抑制T细胞增殖和树突状细胞成熟。目前，在皮肤移植、肾移植、冠心病等领域，均有研究表明sFGL2具有重要的作用[1]。近年来研究发现，sFGL2可调节T细胞反应，对自身免疫性肝炎的发生和进展具有促进作用。肝癌细胞异常表达FGL2可能促进了肿瘤细胞的生长[2，3]。目前，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者sFGL2的变化及其作用还鲜有研究报道。本研究检测了CHB患者在抗病毒治疗前后血清和肝组织sFGL2水平的变化，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年6月～2017年6月我院收治的CHB患者112例，男68例，女44例；年龄29～48岁，平均年龄为（34.1±7.8）岁。乙型肝炎肝硬化患者112例，男70例，女42例；年龄28～67岁，平均年龄为（44.0±7.7）岁。符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的诊断标准[4]，且经肝穿刺组织病理学检查证实。血清HBsAg阳性持续＞6个月，初始接受抗病毒治疗。其中CHB患者轻度38例，中度45例，重度29例。排除其他脏器功能障碍、合并其他慢性肝病、恶性肿瘤、失代偿期肝硬化、药物性肝损伤患者。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 给予所有患者恩替卡韦（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20052237）0.5 mg口服，1次/d。观察72 w。完全应答：HBV DNA阴转、ALT复常；部分应答：HBV DNA阴转或ALT复常；无应答：HBV DNA和ALT均未达到完全应答的标准[5]。

1.3 血清指标检测 采集受试者空腹静脉血5 mL，3000 r/m离心10 min，取血清冻存于-80℃备测。采用ELISA法检测血清sFGL2水平（美国BioLgend公司）；使用日立7600型全自动生化分析仪及其配套试剂测定血生化指标。

1.4 肝穿刺组织病理学检查 使用16 G肝活检穿刺针（美国Bard Magnum型）行肝穿刺活检，组织长度＞1 cm。经甲醛固定、石蜡包埋、连续切片、HE和Masson染色。参考《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的标准[6]，将肝组织炎症活动度分为G1～G4级，将肝纤维化分为S0～S4期。采用免疫组织化学法检测肝组织sFGL2表达，对肝组织石蜡切片行脱蜡、微波修复，过氧化氢孵育10 min，PBS振洗3次；加入1:200稀释的抗sFGL2抗体（美国BioLgend公司），4℃过夜，吸除抗体，PBS洗涤3次；加二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤；加DAB显色15～30 s，终止染色，脱水封固。于光学显微镜高倍视野下选择视野，计数阳性细胞数。

1.5 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件处理数据，计数资料以（n，%）表示，采用x2检验；计量资料以（±s）表示，采用 t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝组织sFGL2表达情况 肝组织细胞sFGL2阳性表达为细胞内棕褐色或棕黄色颗粒（图1、图2）。CHB患者肝组织sFGL2阳性率为63.4%（71/112），肝硬化患者为 82.1%（92/112，P＜0.05）。随病情程度加重，CHB患者肝组织sFGL2表达阳性率增加。

图1 CHB患者肝组织sFGL2表达情况（SP，400×）1a：轻度 CHB；1b：中度 CHB；1c：重度 CHB

图2 肝硬化患者肝组织sFGL2表达（SP，400×）2a：肝硬化患者治疗前；2b：肝硬化患者治疗72 w末

2.2 两组血生化指标和sFGL2水平比较 治疗后，两组患者血清ALT和AST水平均显著降低，肝硬化患者血清sFGL2水平显著高于CHB患者，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 两组血生化和sFGL2水平（±s）比较

表1 两组血生化和sFGL2水平（±s）比较

与肝硬化比，①P＜0.05

例数 ALT（U/L） AST（U/L） sFGL2（μg/L）CHB 治疗前 112 77.5±9.2① 86.2±10.7① 118.6±13.4①治疗后 112 49.8±6.3① 52.3±7.6① 84.7±10.3①肝硬化 治疗前 112 86.9±10.9 101.3±12.5 144.1±17.2治疗后 112 41.8±4.2 42.3±5.4 104.9±19.4

2.3 CHB患者血清sFGL2水平变化情况 在治疗24 w、48 w和72 w，CHB患者血清sFGL2水平分别 为 （98.2±10.8） μg/L、（81.6±9.5）μg/L 和（69.4±8.7）μg/L，呈依次降低趋势。在治疗72 w末，完全应答65例，部分应答31例，无应答16例，其血清 sFGL2水平分别为（74.6±9.1） μg/L、（97.2±11.4） μg/L 和（123.6±15.2） μg/L，组间差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

FGL2具有两种表达形式，一是表达于内皮细胞和巨噬细胞的II型跨膜蛋白；二是CD4+CD8+T细胞分泌的可溶性蛋白。mFGL2分子量约为70 kDa左右，被有关研究[7]证实表达于网状内皮细胞（活化）和巨噬细胞，并具备免疫和凝血效能。sFGL2由Treg细胞分泌，以剂量依赖形式抑制树突状细胞成熟和T细胞增殖。在部分病理或生理状态下，sFGL2可能出现与mFGL2相反的作用[8，9]。在小鼠模型实验发现，sFGL2为Treg细胞活性功能不可或缺的组成成分，并可参与自身免疫性疾病发展的抑制过程[10，11]。另有研究表明，抗sFGL2特异性抗体可促使Treg细胞功能遭受损害，导致CD8+T细胞数增加，且作用强于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）阻断剂，故 sFGL2 可能作为重要的Treg细胞效应分子，通过免疫机制造成肝脏损害[12-14]。

当前，HBV导致的慢性感染患者，其免疫学损伤机制尚未明确。但相关资料显示，外周血Treg细胞在免疫耐受过程中具有重要的参与作用，且HBV可作为启动因子对机体免疫功能产生作用，激发免疫反应，进而造成肝脏损伤[15]。国内外研究发现，FGL2在自发性流产、暴发性病毒性肝炎等以微循环障碍为特征的病理模型动物表达显著升高，其介导的纤维素沉积、免疫和凝血功能障碍等与上述病理学损害关系密切[16，17]。FGL2可催化凝血酶原向凝血酶的转化，开启凝血级联通道，造成纤维素局部沉积，造成肝脏微循环障碍，导致肝细胞坏死。体外实验表明，Tregs细胞可通过sFGL2促进CD8+T细胞增殖[18]。体内实验显示，sFGL2可促使CD8+T细胞干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）等细胞因子分泌，其通过对CD8+T细胞功能的影响导致肝脏损害，但其机制还需进一步探讨[19-20]。本研究结果显示，CHB患者肝组织sFGL2阳性表达率为63.4%，而肝硬化患者肝组织sFGL2阳性表达率为82.1%，两组比较差异有统计学意义。CHB患者血清sFGL2、ALT和AST水平在抗病毒治疗前后有显著的变化，且CHB重度患者sFGL2表达高于中度患者或轻度患者，中度患者又高于轻度患者，提示随CHB病情加重，肝功能损害加重，血清sFGL2水平升高，sFGL2可反映CHB患者的病情。经分析sFGL2参与肝损害机制可能在于，乙型肝炎病毒感染能上调肝内sFGL2表达水平，可激活凝血反应，进而造成局部微循环障碍，加重肝细胞损伤，进而损害肝功能。

CHB患者多存在不同程度的肝纤维化病理学改变，而肝纤维化是一种进展性慢性肝损伤的反映。若临床诊治不及时，可能发展至肝硬化甚或肝癌。已有研究发现，血清sFGL2水平在慢性丙型肝炎患者显著高于健康人，经抗病毒治疗后，血清sFGL2水平降低。外周血sFGL2水平与病情及对治疗的应，答和预后关系密切，肝纤维化及炎性反应愈严重，sFGL2水平愈高。研究表明，sFGL2不仅能够抑制T细胞分化和增殖，而且还可干扰树突状细胞成熟，并可诱导B细胞、肝细胞、窦状内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡，其在自身免疫、肝损伤、移植反应等过程中均具有重要的作用。基于sFGL2可经FcγRIIB受体,抑制树突状细胞成熟和T细胞活化增殖,诱导B细胞凋亡,研究指出，其有望应用于预防、治疗排斥反应及免疫耐受诱导。本研究结果显示，在治疗24周、48周和72周，CHB患者血清sFGL2水平均相比治疗前依次降低。肝硬化组sFGL2在治疗后表达亦降低。CHB患者肝组织sFGL2表达随病情程度加重而增加，在对治疗不同应答反应的CHB患者，完全应答患者血清sFGL2水平低于部分应答或无应答者，部分应答者又低于无应答者，提示sFGL2对CHB患者对治疗应答反应具有指导价值，有助于提示治疗反应，并利于临床疗效和预后的评估。这些作用可能与病毒蛋白激活sFGL2转录，上调sFGL2表达，干扰肝组织微循环，通过免疫损害机制，诱导肝细胞凋亡，加重肝细胞损伤有关。