慢性乙型肝炎患者肝组织自然杀伤细胞G2D表达水平的变化及其临床意义*

钟宋，刘玉元，刘树人，周国柱，刘崇文，欧阳石

据世界卫生组织报道，全球大约有2.4亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），每年约有35万人因HBV感染导致的肝衰竭、肝硬化或肝癌而死亡[1，2]。免疫功能紊乱是影响乙型肝炎患者病情转归的重要因素[3，4]。近年来研究发现，以自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）和树突状细胞为主的非特异性免疫反应在HBV感染后参与抗原提呈和免疫清除等过程，在机体抵抗病毒感染、介导非特异性和特异性免疫应答过程中发挥着重要的作用[5]。G2D是NK细胞触发受体，为II型跨膜蛋白，含有胞外C型凝集素，可以取代其他细胞毒受体进而激活NK细胞毒，以发挥免疫调节作用。G2D可表达于NK细胞、CD8+T细胞、γδ T细胞和某些病理条件下的CD4+T细胞[6]。近年来，NKG2D介导的细胞毒在肝损伤过程中的作用引起了国内外学者的重视。有学者发现HBV感染所致肝衰竭患者外周血NKG2D水平升高，但是NK细胞毒作用和杀伤活性则有所下调[7]。HBV可能通过下调NKG2D配体的表达而逃避NK细胞的免疫监视[8]。就我们所知，既往很少有研究报道不同免疫状态下的慢性乙型肝炎（CHB）患者NKG2D表达水平变化及其临床意义。本研究检测了慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎患者和肝衰竭患者血清和肝组织NKG2D表达水平，旨在探讨NKG2D表达情况及其临床意义，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年7月～2018年7月我院收治的慢性HBV携带者20例，男性11例，女性9例，平均年龄为（36.7±9.0）岁；慢性乙型肝炎患者18例，男性10例，女性8例，平均年龄为（35.9±9.3）岁；慢加急（亚急性）乙型肝炎肝衰竭患者16例，男性9例，女性7例，平均年龄为（36.3±8.8）岁。诊断符合2015年中华医学会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[9]和《肝衰竭诊治指南》[10]。排除其他类型的病毒性肝炎、自身免疫性肝病、嗜酒、药物性肝损伤、妊娠和哺乳期妇女。另选健康体检者20例，男性11例，女性9例，平均年龄为（37.0±9.5）岁。四组人群在性别和年龄方面无统计学差异，具有可比性。受试者签署知情同意书。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 外周血NK细胞及血清穿孔素（PFP）和颗粒酶B水平检测 采集 EDTA抗凝的新鲜静脉血8 ml，充分混匀，在6 h内采用聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H，华精生物高科技有限公司，中国上海）密度梯度离心法得到外周血单个核细胞（PBMC）。将PBMC冻存液加入PBMC中混匀，每管0.6～0.8 mL，置于冻存管中，并于-80℃冰箱中冻存。将已分离冻存的PBMC于37℃水浴解冻后，调整细胞数为1×1016/L，将细胞置于96孔板培养，5 d后取培养的细胞悬浊液，加入抗CD16+/CD56+和抗CD3/PE抗体（BD公司），进行流式细胞仪分选。将分选后的细胞悬浊液继续培养：取培养3 d的已分选细胞，用 RPMI1640（Millipore，USA）洗涤 1 次，1100 r/m（r=18 cm）离心 4 min，用 RPMI1640 3 mL重悬细胞，置于6孔板，37℃，体积分数5%CO2培养2 h后，经滤网过滤，PBS洗涤 2次，1000 r/m（r=18cm）离心10 min，加入抗hNKG2D-APC（BD公司），室温避光孵育30 min，加入PBS 1 mL洗涤，1000 r/m（r=18cm）离心 10 min，弃上清，加入10 g/L多聚甲醛溶液200μL固定细胞，24 h内上流式细胞分选仪（BDInflux，美国）检测。通过酶标仪（BioRad450，美国）采用ELISA法检测血清PFP和颗粒酶B水平（武汉博士德生物有限公司）。

1.3 肝穿刺 所有病例经 B超检查，在超声引导下行肝穿刺 活检，经超声波定位后，在局部麻醉下，用16 G穿刺针采用1秒钟快速穿刺活检法，取长约1.5～2.0 cm肝组织。正常肝组织取自在本院手术切除的肝血管瘤旁肝组织。采用荧光定量PCR法检测肝组织NK G2D mRNA水平，采用Western bloting法检测肝组织NK G2D蛋白表达水平，蛋白表达水平为目的蛋白条带恢度与内参（GAPDH）的比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。以“±s”表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法；样本率的比较采用x2检验或Fisher精确概率计算；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组血生化、血清和病毒学指标比较 见表1。

2.2 四组外周血单个核细胞百分比及血清穿孔素和颗粒酶B水平比较 CHB和肝衰竭患者NK细胞和G2D NK细胞百分比及血清学指标均显著高于HBV 携带者（P＜0.05，表2）。

表1 四组血生化、血清和病毒学指标（±s）比较

表1 四组血生化、血清和病毒学指标（±s）比较

与 HBV 携带者比，①P＜0.05；与 CHB 组比，②P＜0.05

例数 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBVDNA（lgU/ml） HBeAg（mIU/ml）HBV携带者 20 28.6±6.1 42.3±6.0 11.5±5.4 8.0±0.6 366.2±96.7 CHB 18 179.2±36.7① 126.4±56.8① 70.6±30.4① 5.1±0.6① 267.2±125.7①肝衰竭 16 267.2±69.2①② 196.4±75.2①② 267.2±76.4①② 4.5±0.4① 246.3±184.1①健康人 20 37.4±4.6 37.1±7.3 16.3±3.6 - -

表2 四组外周血单个核细胞百分比及血清穿孔素和颗粒酶B水平（±s）比较

表2 四组外周血单个核细胞百分比及血清穿孔素和颗粒酶B水平（±s）比较

与 HBV 携带者比，①P＜0.05；与 CHB 组比，②P＜0.05

例数 NK细胞 G2D+NK细胞 穿孔素（ng/L） 颗粒酶B（ng/L）HBV 携带者 20 5.1±1.5 3.4±1.1 15.2±3.2 23.0±3.5 CHB 18 8.5±2.0① 12.3±2.1① 31.5±3.6① 52.5±4.0①肝衰竭 16 8.8±1.6① 19.0±2.4①② 60.2±11.0①② 126.8±30.1①②健康人 20 14.2±2.1① 7.5±1.5① 13.9±4.0 21.1±3.9

2.3 四组肝组织NKG2D mRNA和蛋白表达情况比较 四组间肝组织NKG2D mRNA和NKG2D蛋白的比较均有差异（P＜0.05，表3）。

表3 四组肝组织NKG2D mRNA和蛋白表达（±s）比较

表3 四组肝组织NKG2D mRNA和蛋白表达（±s）比较

与 HBV 携带者比，①P＜0.05；与 CHB 组比，②P＜0.05

例数 NKG2D mRNA NKG2D蛋白HBV携带者 20 0.1±0.0 0.0±0.0 CHB 18 3.5±0.9① 1.1±0.2①肝衰竭 16 7.0±1.2①② 1.8±0.2①②健康人 20 0.6±0.2① 0.3±0.0①

3 讨论

CHB发病机制尚未明了，目前认为可能与炎症和免疫功能紊乱的变化有关。机体感染HBV后，自身免疫状态是决定疾病转归的关键[11，12]。NK细胞是人体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗感染和免疫调节等生理过程有关，并且在某些病理条件下可参与自身免疫及超敏反应，可以识别靶细胞和杀伤介质[13，14]。一般认为，NK细胞直接从骨髓中衍生，其发育和成熟依赖于骨髓的微环境。NK细胞的功能受到其表面受体的影响和调节。NK受体包括抑制性受体和激活性受体，抑制性受体主要是NKG2A，激活性受体包括 NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C和NKG2D。NKG2D的单独活化即可刺激NK细胞活化，并且可以克服抑制性受体的强势信号。NKG2D的表达是机体抗肿瘤和抗病毒感染的关键因素[15]。

近年来，NKG2D介导的细胞毒在肝损伤发病过程中的作用引起了国内外学者的重视[16-18]。NKG2D在正常人、慢性HBV携带者和乙型肝炎患者外周血和肝组织水平存在明显差异。既往研究发现，NKG2D介导的细胞毒在激活NK细胞对k562细胞和HepG2细胞的杀伤过程中起到重要作用[19]。NKG2D表达水平升高可激活NK细胞毒性作用，促进肝衰竭的发生和发展。NKG2D表达水平降低可能使HBV逃避NK细胞的杀伤，致感染慢性化[20]。

本研究发现，慢性乙型肝炎患者和HBV相关慢加急（亚急性）肝衰竭患者外周血NK细胞频率较慢性HBV携带者显著升高，提示NK细胞参与了HBV感染患者的免疫耐受和抗HBV免疫。本研究并未发现肝衰竭和HBV携带者NK细胞频率的差异，而在动物实验研究中有学者发现肝衰竭动物NK细胞水平较慢性乙型肝炎高[21]，研究结果的差异性可能与样本量或物种有关。本研究发现，不同免疫状态下的个体NKG2D+NK细胞频率有明显差异，免疫过强者其水平最高，在一定程度上反映NK细胞对HBV杀伤作用依赖于NKG2D。我们检测了血清穿孔素和颗粒酶B水平，既往研究已证实NKG2D可以通过刺激靶细胞分泌穿孔素和颗粒酶B等杀伤介质发挥效应[22，23]。免疫过强患者NKG2D+NK细胞频率较慢性乙型肝炎患者高，说明NKG2D过度活化对NK细胞毒性作用和肝组织病理学损伤的作用，甚至是肝衰竭发生的原因。

本研究发现，健康人外周血单个核细胞NKG2D+NK细胞频率及肝组织NKG2D mRNA和蛋白表达水平均高于病毒携带者，可能是因为慢性HBV携带者NK细胞活化性受体受到抑制，使得机体维持对HBV感染后的免疫耐受状态。有研究发现，免疫活动期慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞水平较健康人群低，且NKG2D表达水平下降。NKG2D刺激分泌的γ干扰素水平与HBV DNA载量呈负相关[23]。NKG2D对NK细胞活化的影响需要未来深入研究。对患者病情程度的评价缺乏量化指标，例如肝纤维化程度和炎症程度等。虽然NKG2D主要表达于NK细胞，但是G2D也可表达于CD8+T细胞、γδ T细胞和某些病理条件下的CD4+T细胞，这些对本研究结果可能也有一定的影响。

综上所述，NK细胞对肝损伤患者抗病毒应答和免疫调控具有重要的意义。NKG2D可能通过NK细胞合成分泌穿孔素和颗粒酶B等杀伤介质发挥效应。不同免疫状态下HBV感染患者NKG2D表达存在差异，下调NKG2D可能通过抑制NK细胞而改善免疫性肝损伤，甚至能预防肝衰竭的发生。