大豆RN型细胞质雄性不育系雌性育性对异交率的影响

张井勇，闫昊，彭宝，张春宝，李慧，王鹏年，丁孝羊，林春晶，孙寰，赵丽梅，张伟



大豆RN型细胞质雄性不育系雌性育性对异交率的影响

张井勇，闫昊，彭宝，张春宝，李慧，王鹏年，丁孝羊，林春晶，孙寰，赵丽梅，张伟

（吉林省农业科学院大豆研究所/大豆国家工程研究中心，长春 130033）

【目的】研究RN型大豆细胞质雄性不育系、保持系雌性育性差异，明确RN型大豆细胞质雄性不育系是否存在雌性育性降低的现象，探讨不育系雌性育性与异交率的相关性。【方法】首先在200余份RN型细胞质雄性不育系中，依据异交结实率高低，选择有代表性的不育系及保持系6对；然后通过网室内投放蜜蜂传粉对不育系进行异交率鉴定，确定不育系的异交率高低水平；再对6份不育系利用同一父本恢复系进行不去雄人工杂交试验，明确不同异交结实率不育系在接受外来花粉受精结实方面是否存在差异；最后利用同一恢复系作共同父本，通过去雄、不去雄人工平行杂交方法，研究不育系及对应保持系间杂交成活率差异，对6份不育系及6份对应保持系雌性育性进行分析，同时分析不育系异交率与雌性育性的相关性。【结果】网室异交率鉴定表明，供试6份不育系异交率存在显著差异，最高达49.46%，最低仅15.94%。6份不育系在人工授粉杂交成活率上也存在显著差异，高异交率不育系（JLCMS101A和JLCMS82A）杂交成活率显著高于中、低异交率不育系，中异交率不育系（JLCMS9A和JLCMS47A）杂交成活率显著高于低异交率不育系（JLCMS89A和JLCMS31A）。人工去雄平行杂交成活率，高、中异交率不育系显著高于低异交率不育系；高、中、低异交率保持系间杂交成活率无显著差异；杂交成活率在高、中异交率不育系与对应保持系间无显著差异，而低异交率不育系的杂交成活率显著低于其对应保持系的杂交成活率。人工不去雄平行杂交成活率，高异交率不育系杂交成活率显著高于中、低异交率不育系杂交成活率；高、中、低异交率保持系间杂交成活率无显著差异；高、中异交率不育系的杂交成活率与对应保持系的杂交成活率无显著差异，而低异交率不育系的杂交成活率则显著低于其对应保持系的杂交成活率。【结论】在大豆RN型细胞质雄性不育系中，高异交率不育系雌性育性正常，低异交率不育系中存在因雌性育性差而影响正常结实的情况，雌性育性差是造成其异交结实性低的原因之一，不同异交率不育系对应保持系雌性育性均正常；不育系网室异交率与不育系去雄杂交成活率呈极显著正相关，不育系网室异交率与不育系不去雄杂交成活率也呈极显著正相关。去雄和不去雄平行杂交结果均可用于鉴定不育系的雌性育性。

大豆；不育系；异交率；雌性育性

0 引言

【研究意义】杂种优势利用是提高作物产量的主要途径，但大豆杂种优势利用研究起步较晚，1993年育成世界上第一个可实际应用的大豆RN型细胞质雄性不育系，并很快实现了“三系”配套[1-4]。2002年，孙寰等[5]审定了世界上第一个大豆杂交种。此后，张磊等[6]、赵丽梅等[7]、盖钧镒等[8]、赵团结等[9]和Nie等[10]相继发现了6种不同来源的不育细胞质类型，不育细胞质分别来源于栽培大豆W202、ZD8319、XXT、N21566、N2877和N23239，并育成多个质核互作雄性不育系。至今，全国已有12个春大豆杂交种和4个夏大豆通过审定[5,11-22]，并已经在生产上大面积示范推广应用。然而，仍有一些因素制约杂交大豆大规模商业化种植。特别是一些产量优势突出的组合，制种产量仍不理想，导致种子价格过高，农民种植积极性受影响。制种产量高低，直接与母本不育系的田间异交结实率（即异交率，下同）有关。异交率受诸多条件影响，传粉昆虫种类、群体大小，制种基地的大环境和制种田的局部环境[23-25]，亲本的基因型以及亲本的田间布局和生长状况都对不育系的田间异交率产生很大影响[26-27]。单株开花多寡、花器构造、花粉数量与质量、花的分泌物等都是影响对昆虫吸引力和异交率的因素[28]。而雌性育性的高低，对异交率影响也不容忽视[29]。【前人研究进展】大豆核不育系雌性育性的相关研究较早，Bernard等[30]利用人工平行杂交发现，正常可育大豆结实率为51%，ms2ms2的结实率略低，为42%，而ms1ms1仅为16%，核不育基因对ms1ms1雌性育性影响很大。宋启建等[31]研究证实，大豆隐性核不育材料异交结实率的高低在很大程度上由雌性育性决定，而雄性不育材料的雌性育性常伴有不同程度的降低。对其降低程度可用不育度表示，不育度可用平行杂交的试验测得。赵团结等[32]对大豆显性核雄性不育突变体N7241S进行遗传分析，发现N7241S不育株的雌性育性与正常可育株无差异，与隐性核不育种质ms1、ms2相比，具有高的自然异交结实率，得出N7241S属雄性不育、雌性育性正常突变体。赵团结等[33]研究了大豆不育性自然变异的特点，发现得到的17份核不育材料中表现为雄性完全不育或部分不育，利用人工平行杂交试验及不育株自然结荚状况将不育种质的雌性育性分为可育、部分不育和完全不育3类，雌雄育性组合有6种不育类型；研究表明大豆不育株的异交结实性与雌性育性有关。李曙光等[34]利用人工平行杂交试验发现，诱变获得的核雄性不育突变体NJS-1H雌性育性不正常。细胞质雄性不育系雌性育性相关研究较少，主要原因是可利用的细胞质雄性不育系数量有限。在大豆中发现质核互作雄性不育系后，中国学者先后对细胞质来源不同的各类不育系进行了雌性育性测验。孙寰等[2]采用平行杂交试验，证明了RN型细胞质雄性不育系OA和同型保持系OB雌性育性无显著差异。张磊等[6]以中油89B为不育胞质源育成的不育系W931A，雌性育性也不受影响。盖钧镒等[8]以N8855为不育细胞质源，育成了不育系NJCMS1A，平行杂交试验表明，雌性育性正常。Zhao等[35]对以N21566为不育胞质源育成的不育系NJCMS3A进行了雌性育性研究，平行杂交试验表明雌性育性也正常。【本研究切入点】上述相关研究，仅针对某一个或几个少数不育系和保持系进行平行杂交试验，由同一个不育细胞质育成的大量不育系，由于轮回亲本不同，核基因组差异很大，不育系异交率高低差异也很大，它们之间雌性育性是否也有差异？是否受核基因组背景影响？【拟解决的关键问题】本研究通过确定RN型细胞质雄性不育系是否存在雌性育性降低的现象，明确不育系异交率高低与雌性育性相关性，用以指导杂交种育种实践，并为高异交率及其机理研究提供理论基础，提高大豆高异交率不育系选育效率，降低制种成本，推动杂交大豆产业化进程。

1 材料与方法

1.1 供试材料

不育系6份及对应保持系6份，共12份材料（表1），包括高异交率材料2对：JLCMS82A和JLCMS82B、JLCMS101A和JLCMS101B（“A”代表不育系，“B”代表保持系,下同）；中异交率材料2对：JLCMS47A和JLCMS47B、JLCMS9A和JLCMS9B；低异交率材料2对：JLCMS31A和JLCMS31B、JLCMS89A和JLCMS89B；共用父本恢复系JLCMS2R。不育系高、中、低异交率划分标准以多年网室异交率均值为参考，无固定数值区分，在200多对不育系及保持系中，高异交率材料选自网室异交率排名稳定在前三分之一的材料，中异交率材料选自网室异交率排名稳定在中间三分之一的材料，低异交率材料选自网室异交率排名后三分之一的材料。

表1 试验材料

1.2 不育系网室异交率鉴定

2012—2016年，在范家屯杂交大豆实验基地，隔离网室内进行试验。

试验采用随机区组设计，3次重复，每个区组随机播种6份不育系及对应保持系，小区为独立网室，大小为4 m×6 m×2.5 m，小区内9行播种，不育系保持系按行比1﹕1种植，行距60 cm，穴播，株距30 cm，父母本每穴均保苗2株。出苗后的田间管理同大豆生产田，开花前及时进行除草除虫，开花后禁止施用杀虫剂，避免对传粉昆虫造成危害，影响传粉及结实。开花期随时观察试验田情况，避免大型动物、人等因素干扰野生昆虫传粉。

1.3 花粉育性检测

开花期，根据亲本花色、叶形等表型性状去除田内杂株，同时利用手检不育系花粉，拔除可育植株。开花期每个网室投放1箱蜜蜂，群体大小约800只，定期检查并饲喂蜜蜂。

1.4 田间调查及结荚数统计

在不育系及同型保持系鼓粒期至成熟期，在每个试验区中间位置对待测不育系及同型保持系分别取样，每行连续取5穴（10株）母本不育系和相同株数的同型保持系，调查结荚数，计算平均结荚数。根据以下公式计算不育系异交结实率。

异交结实率=（母本不育系单株平均结荚数/对应保持系单株平均结荚数）×100%。

1.5 不育系人工杂交试验

2012—2014年，在范家屯杂交大豆实验基地，设置播种网室大小为18 m×6 m×2.5 m，6份不育系与恢复系JLCMS2R相邻种植，株距行距同1.2，3次重复，为防止天然传粉昆虫影响试验结果，开花前扣网，使用杀虫剂杀死可能存在的传粉昆虫；在不育系开花期，对母本不育系单株检查花粉育性，取样大小为次日开放的花蕾，70%酒精固定，在显微镜下观察花粉败育率，染色方法为I2-KI染色，花粉100%不育的单株用于杂交授粉试验；天气晴好情况下，一个技术工人对每个不育系每天杂交授粉30朵花（每次重复10朵，3次重复），杂交方式为不去雄授粉，选择新开放的花朵，杂交时不去除花萼、旗瓣、翼瓣及花药，仅去除龙骨瓣，杂交授粉10 d，R5期调查杂交成活率。

1.6 平行杂交试验

2015—2016年，在范家屯杂交大豆实验基地，网室种植方式及花粉育性检测同1.2和1.3，天气晴好情况下，每天早晨7:00—11:00由3名技术工人员分别对所有试验材料进行人工杂交授粉，为了消除人员之间因熟练程度不同产生的误差，每人每天都做所有试验组合，而且每个组合所做的花数相同，选取母本植株中部花朵授粉，每株每个节位不超过2朵，父本花粉来源均为高异交率恢复系JLCMS2R。2015年分别以6份不育系和6份保持系为母本杂交，授粉方式为人工去雄后授粉，母本选择次日开放的花蕾，杂交时去除花萼、旗瓣、翼瓣及龙骨瓣，同时摘除花药，避免损伤柱头，父本每朵花仅给一朵母本花授粉，每份材料累计杂交150朵花以上。R5期调查每个材料杂交荚成活数量。为进一步降低人工去雄对雌蕊的影响，2016年对12份材料进行不去雄的平行杂交试验，授粉方式为人工不去雄授粉，母本选择次日开放的花蕾，杂交时去除花萼、旗瓣、翼瓣及龙骨瓣，使柱头及花药露出，但不摘除花药，父本每朵花仅给一朵母本花授粉，每份材料累计杂交150朵花以上。

1.7 数据处理

利用EXCEL2010及SPSS19.0[36]统计软件进行统计分析。

2 结果

2.1 不育系网室异交率差异

网室隔离条件下利用蜜蜂授粉鉴定异交率（表2），结果表明，不同基因型不育系间异交率差异达显著水平，高异交率不育系JLCMS101A异交率达49.46%，而低异交率不育系JLCMS89A异交率仅15.94%，两者间相差3倍以上，高异交率不育系（JLCMS101A和JLCMS82A）的异交率显著高于中异交率不育系（JLCMS47A和JLCMS9A），中异交率不育系（JLCMS47A和JLCMS9A）的异交率显著高于低异交率不育系（JLCMS89A和JLCMS31A）。由此可以得出：异交率在不同基因型间差异很大，同一基因型在年度间也存在显著差异。

表2 网室内利用蜜蜂传粉异交率鉴定（2012—2014年，%）

不同小写字母表示在=0.05水平差异显著。下同

Different lowercase letters represent significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2 不育系杂交授粉试验

利用同一父本恢复系对不同基因型不育系进行人工不去雄杂交授粉，杂交授粉成活率在各基因型不育系间存在显著差异（表3），杂交成活率最高为33.08%（高异交率不育系JLCMS101A），其次为31.37%（高异交率不育系JLCMS82A），杂交成活率最低为19.89%（低异交率不育系JLCMS31A），高异交率不育系（JLCMS101A和JLCMS82A）和中异交率不育系（JLCMS47A和JLCMS9A）的杂交成活率显著高于低异交率不育系（JLCMS89A和JLCMS31A）杂交成活率，表明对不育系开放花朵人工杂交授粉，高异交率不育系花朵，更容易接受外来花粉而受精结实，其受精结实性好于低异交率不育系，可以理解为此时其雌性育性要明显好于低异交率不育系的雌性育性，因此利用不育系对大豆种质进行测交时，选用高异交率不育系作母本杂交可以获得相对多的杂交荚。

进一步对不育系网室异交率与其杂交成活率进行相关分析，结果表明，杂交成活率与网室异交率呈极显著正相关，相关系数为0.840。

表3 不同不育系人工不去雄杂交授粉成活率（2012—2014，%）

表4 不同异交率不育系及保持系去雄平行杂交试验结果（2015年）

2.3 去雄平行杂交方法鉴定雌性育性

通过对6份不育系及6份保持系人工去雄杂交授粉，分析各自的杂交成活率（表4），不育系的杂交成活率范围在38.68%—56.61%，高异交率不育系杂交成活率显著高于低异交率不育系杂交成活率；保持系的杂交成活率变化范围不大，最低43.27%，最高48.23%，高、中、低异交率保持系间杂交成活率无显著差异，说明三者雌性育性无差异；对具有相同细胞核来源的一对不育系及保持系而言，杂交成活率在高、中异交率不育系与对应保持系间无显著差异，而低异交率不育系的杂交成活率显著低于其对应保持系的杂交成活率；说明低异交率大豆不育系与其对应保持系比，雌性育性降低，而高、中异交率大豆不育系的雌性育性与其对应保持系比没有降低或正常。

2.4 不去雄平行杂交方法鉴定雌性育性

由表5可以看出，在对6份不育系及6份保持系不去雄杂交授粉情况下，高异交率不育系杂交成活率显著高于中、低异交率不育系杂交成活率，这与表3的试验结果基本一致；高异交率保持系与中、低异交率保持系间杂交成活率无显著差异，说明三者间雌性育性无差异；对具有相同细胞核来源的一对不育系及保持系而言，高、中异交率不育系的杂交成活率与对应保持系的杂交成活率无显著差异，而低异交率不育系的杂交成活率则显著低于其对应保持系的杂交成活率，这表明在排除去雄损伤柱头的情况下，低异交率大豆不育系的雌性育性与其对应保持系比，雌性育性降低，而高异交率大豆不育系的雌性育性与其对应保持系比没有降低或正常。因此，供试低异交率保持系在转育为不育系后存在雌性育性降低的现象。

2.5 相关性分析

通过对2015年和2016年6份不育系的网室异交率（电子附表2015—2016网室异交率）与平行杂交成活率相关分析（表6），可见不育系网室异交率与不育系不去雄杂交成活率呈极显著正相关，相关系数为0.916；不育系网室异交率与不育系去雄杂交成活率也呈极显著正相关，相关系数为0.916；不育系网室异交率与保持系杂交成活率不相关，不育系杂交成活率与保持系杂交成活率也不相关。

表5 不同异交率不育系及保持系不去雄平行杂交试验结果（2016年）

（）中数字代表伪杂种个数nonhybrid pods

表6 网室异交率与平行杂交成活率相关系数（Pearson相关性）

**表示在0.01水平（双侧）显著相关 **significant at the 0.01 probability level

3 讨论

3.1 不育系杂交成活率年度间的差异

通过对不育系开放花朵杂交授粉试验、花蕾去雄及不去雄平行杂交试验比较发现，不育系在不去雄杂交授粉情况下（表3），理论上不会损伤柱头，其杂交成活率应该较高，但实际结果与人工去雄杂交授粉比较（表4），其杂交成活率反而低，查询2012—2014年气象记录发现，这3年（特别是2013年）开花期阴雨天较多（气象数据文中未列出），这可能直接影响正常授粉效果而降低杂交荚成活率，而进一步的重复试验（表5）表明不育系的不去雄杂交成活率明显高于去雄的杂交成活率。

3.2 不育系与保持系间杂交成活率差异的原因

本研究人工去雄平行杂交试验中（表4），相对保持系来说，不育系花药分散不黏连，人工去雄较容易，且不容易损伤柱头，理论上，不育系授粉的成功率应该比保持系高，对于雌性育性正常的高异交率材料而言，与这一假设吻合，但低异交率不育系杂交成活率低于对应保持系，雌性育性差可能是原因之一。

3.3 影响异交率的其他可能因素

人工杂交同昆虫传粉相似，均有无效授粉，如父本无花粉或有花粉但没有授粉成功，授粉时花粉没有完全发育成熟、延迟成熟等；导致低异交率不育系雌性育性差的原因，也可能与柱头发育不正常有关，如柱头畸形、延迟成熟等，此方面有待于进一步研究。

此外，本研究中，高异交率不育系JLCMS101A和JLCMS82A分别存在1.05%和0.54%自交结实，产生自交结实的原因：可能是母本不育系植株开花过程中，个别节位花朵的花粉败育率变化，产生自交结实现象。已有研究报道，许多核雄性不育系及个别细胞质雄性不育系的育性稳定性易受田间环境影响而产生自交结实[37]。“三系”杂交种制种中，如果因为不育系的不稳定而产生自交结实的现象，会导致杂交种中混入不育系种子，杂交种在生产田会出现不育株（不结实单株）而导致减产，因此，选育育性稳定的不育系十分重要。

本研究中试验材料按张井勇等[38]的分类标准进行分类，2个高异交率不育系为极易被恢复不育系，而2个低异交率不育系为不易被恢复不育系，吉林省农业科学院杂交大豆研究团队在多年的杂交种育种实践中也发现多数高异交率不育系被恢复程度好，相反，低异交率不育系被恢复程度差。由此可看出不育系的异交率似乎与其被恢复性有一定的联系，二者控制该性状的相关基因可能存在连锁关系，此推断还需要进一步研究。

此外，白羊年等[39]发现不育系的异交率与保持系的散粉性有关。张井勇等[28]报道不育系的异交率与花的泌蜜量也有关。因此，影响大豆不育系异交率的其他因素还需进一步研究。

3.4 如何选育雌性育性正常的高异交率不育系

在大豆RN型低异交率不育系中存在雌性育性差的现象，但其对应的保持系雌性育性正常，雌性育性通过观察植株形态、花器构造很难发现，只有在转育为不育系后，通过平行杂交确认，不育系在育种过程中需要回交5代以上，当转育成功后，因雌性育性差而淘汰势必增加了无效工作，因此提前对雌性育性进行判断尤为重要，在育种过程中，可依据与异交率显著相关的其他性状，先对雌性育性有一个简单判断，再结合田间异交率鉴定方法，可选育出雌性育性正常的不育系，为此，张井勇等[40]提出一种高效大规模鉴定大豆种质昆虫吸引力的方法，可以借鉴。

4 结论

在大豆RN型细胞质雄性不育系中，高异交率不育系雌性育性正常，低异交率不育系存在雌性育性差而影响正常结实的现象，雌性育性差是造成其异交结实性低的原因之一，不同异交率保持系雌性育性均正常。不育系网室异交率与不育系不去雄杂交成活率和去雄杂交成活率均呈极显著正相关，不育系网室异交率与保持系杂交成活率无相关性，不育系杂交成活率与保持系杂交成活率也不相关。去雄和不去雄平行杂交试验均可用于鉴定不育系的雌性育性。

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Effects of Female Fertility of RN Type Male-Sterile Lines on Outcrossing rate

ZHANG JingYong, YAN Hao, PENG Bao, ZHANG ChunBao, LI Hui, WANG PengNian, DING XiaoYang, LIN ChunJing, SUN Huan, ZHAO LiMei, ZHANG Wei

(Soybean Research Center of Jilin Academy of Agriculture Sciences/National Engineering Research Center for Soybean, Changchun 130033)

【Objective】To study the differences in female fertility of RN-type soybean cytoplasmic male sterile lines (A-lines) and maintainer lines (B-lines), determine whether there is a decline in female fertility in RN-type soybean cytoplasmic male sterility lines, and explore the correlation between female fertility and outcrossing rate in male sterile lines. 【Method】Firstly, 6 pairs of sterile lines and maintainer lines were selected from more than 200 RN-type cytoplasmic male sterile lines; outcrossing rates among these lines were different. Second, the outcrossing rate of male sterile lines was evaluated using honeybee pollination in net cages. Third, six male sterile lines were pollinated by non-removing stamen test, with male parents of the same restorer line, to determine whether there were differences in fertilization and podding. Finally, the differences in survival rate between sterile lines and maintainer lines were studied by removing stamens and non-removing stamens parallel cross test with the same restorer line used as the male parent. 【Result】The outcrossing rates in cages were significantly different among the six sterile lines tested: the highest outcrossing rate was 49.46% and the lowest outcrossing rate was 15.94%. there were significant differences among survival rates of artificial crosses of six sterile lines tested: the survival rate of sterile lines with a high outcrossing rate were significantly higher than that of medium and lowoutcrossing rate sterile lines and the survival rate of sterile lines with medium outcrossing rate were significantly higher than that of lowoutcrossing rate sterile lines. For crossing survival rate after artificially removing stamens, A-lines with high and medium outcrossing rates were significantly higher than that with lowoutcrossing rates; there were no significant differences among B-lines with high, medium, or low outcrossing rates; there were no significant differences among high A-lines, middle A-lines, and their corresponding B-lines, while A-lines with a low outcrossing rate were significantly lower than their corresponding B-lines. For crossing survival rate by artificially not removing stamen, A-lines with a high outcrossing rate were significantly higher than that with medium or lowoutcrossing rates; there were no significant differences among B-lines with high, medium and low outcrossing rates; there were no significant differences among high A-lines, middle A-lines, and their corresponding B-lines, while A-lines with low outcrossing rate were significantly lower than their corresponding B-lines. 【Conclusion】 For RN-type cytoplasmic male-sterile lines of soybean, female fertility of A-lines with high outcrossing rates were normal and female fertility of a few A-lines with low outcrossing rates were poor, affecting their seed setting. Female fertility of B-lines with different outcrossing rates were all normal, the outcrossing rate of A-lines in cages were significantly positively correlated with their crossing survival rate following artificial stamen removal and in plants where the stamen was not removed, the outcrossing rates of A-lines in cages were not correlated with their B-lines’ crossing survival rate. All parallel crosses by removing and non-removing stamens can thus be used to evaluate female fertility of A-lines.

soybean; Male-Sterile Lines; outcrossing rate; female fertility

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.003

2018-11-23；

2019-01-23

吉林省农业科技创新工程（CXGC2017ZY004）、吉林省科技发展计划项目（20190101007JH；20170201001NY）、国家自然科学基金青年基金（31301399）

张井勇，Tel：15699526311；E-mail：zhangjy@cjaas.com。 通信作者赵丽梅，E-mail：lmzhao@cjaas.com。通信作者张伟，E-mail：zw.0431@163.com

（责任编辑 李莉）