白藜芦醇对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞OPN表达及细胞功能的影响*

李小静，刘川川，鲍 金，刘辉琦，刘 杰，曹学锋，王生兰

(青海大学医学院，青海 西宁 810001)

高原性心脏病(high altitude heart disease，HAHD)以慢性低压低氧引起的肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)为基本特征并呈右心室肥厚或右心功能不全。骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)是一种分泌型糖基化磷蛋白，广泛分布于血管等组织，其作用与细胞的黏附、迁移和血管的生成等有关，很多研究已证明OPN可作为PAH治疗靶点。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种生物性很强的天然多酚类物质，是预防和治疗心脑血管疾病的重要化学预防剂。有研究表明，Res可以降低不同组织细胞中OPN的表达[1，2]，但Res对PASMC OPN的表达是否有抑制作用？本研究探讨Res对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞OPN表达及细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

ɑ-SMA一抗购于武汉博士德公司；ɑ-Tubulin一抗购于北京索莱宝科技有限公司；OPN 抗体购于Abcam公司；Gibco 胎牛血清购于赛默飞公司；白藜芦醇购于生工生物工程公司；MTS试剂购于Promega公司。BCA蛋白定量试剂盒购于赛默飞公司。三气培养箱购于TECAN公司；ABI 7500荧光定量PCR仪购于Applied Biosystems公司；Nanodrop 2000购于赛默飞公司。

SPF级SD大鼠购于甘肃省中医院实验动物中心[合格证号：SYXK(甘)2011-0001]，6周龄，雌雄各半，体重约180 g±20 g。

1.2 鉴定方法

用3%苯巴比妥行腹腔注射麻醉大鼠后再用75%乙醇浸泡数秒后置于超净台。用手术剪迅速剖开大鼠胸腔，取出心肺组织，放入4 ℃预冷PBS缓冲液中洗去组织中的血液，剔除心脏，沿肺动脉主干逐级分离出肺动脉分支，取 2～3级肺动脉用于后续实验。在显微镜下用刀片轻轻刮除肺动脉内层内皮组织和外层纤维外膜，用组织剪将剩余中间层肺动脉平滑肌剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块放入培养瓶中(含3mL20% FBS的DMEM液)浸润，先将培养瓶直立放置于常氧培养箱(37℃，5% CO2/20% O2)中培养，6 h后水平放置继续培养。待细胞长出密度约80%时，用α-actin免疫组化法鉴定为平滑肌细胞后将其进行传代培养，培养3～6代的PASMC用于后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 将常氧组、低氧组、低氧+0.1%DMSO组、低氧+ Res不同剂量(10、25、40、80、100、150、200μM剂量)组培养24 h和48 h后的PASMC用MTS法筛选Res对PASMC的最佳抑制浓度。

1.3.2 将常氧组、低氧对照组、低氧+0.1%DMSO组、低氧+ Res低剂量组、低氧+Res高剂量组中的常氧组置于常氧培养箱(37℃，5% CO2/20% O2)中，低氧组置于低氧培养箱(37℃，5% CO2/2% O2)中，培养24 h和48 h后的PASMC用于qRT-PCR、western blot、MTS检测和细胞划痕实验分析。

1.4 Res对PASMC的最佳抑制浓度筛选方法

采用不同浓度梯度的Res对低氧条件下的PASMC进行干预，用MTS法筛选出Res对低氧PASMC有抑制作用的最低剂量和最高剂量浓度：培养瓶对数期生长的细胞用胰酶消化，调整细胞浓度至1×105/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL，每组6个重复。待细胞贴壁后吸弃培养基，加入无血清DMEM培养基饥饿处理6 h后进行不同浓度的Res干预，将常氧组置于常氧培养箱(5% CO2/20% O2)培养，低氧组置于低氧培养箱(5% CO2/2%O2)培养，分别培养24 h和48 h后每孔加入MTS溶液20 μL，继续孵育2 h后用酶标仪检测各孔吸光值(波长490nm)。

1.5 PASMC OPN表达量的检测方法

1.5.1 用qRT-PCR法检测PASMC OPN mRNA表达量：用Tirzol 法提取各组PASMC总RNA、Nanodrop 2000软件测定总RNA浓度、1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。每组取1000 ng RNA逆转录成cDNA， 用PCR仪进行qPCR反应，引物序列见表1[3]，扩增条件： 起始模板变性：50 ℃ 2 min(1cyscle)；94 ℃ 15 min(1cyscle)；在PCR循环中行模板变性：94 ℃ 10 s；退火、延伸：60 ℃ 34 s(40cyscle)。数据以2-ΔΔCt法行统计学分析。

表1OPN和18S基因PCR特异性引物序列

Table 1PCR specific primer of OPN and 18S gene

1.6 PASMC 功能的检测方法

1.6.1 用MTS法检测各组PASMC增殖力：对数期生长的PASMC用胰酶消化，调整细胞浓度至1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL，每组重复6次。常氧组置于常氧培养箱(5%CO2/20% O2)培养，低氧组置于低氧培养箱(5%CO2/2%O2)培养，24 h和48 h后每孔加入MTS溶液20 μL，继续孵育2 h后用酶标仪检测各孔吸光值(波长490nm)。

1.6.2 用细胞划痕法检测各组PASMC迁移力：培养的PASMC用胰酶消化，离心(5000r/min)5 min，先用marker笔在6孔板背面用直尺均匀划横线，调整细胞浓度至3×105个/孔后接种于6孔板中。常氧组置于常氧培养箱中、低氧组置于低氧培养箱中培养，待细胞贴壁后，用无菌枪头比着直尺垂直于背面的横线均匀划痕，加入无血清培养基用倒置显微镜观察拍照，按以上分组进行Res干预，继续培养24 h和48 h，用倒置显微镜观察并拍照。采用image J软件分别测量各组0、24、48 h的划痕宽度，平均迁移距离=(0h的划痕宽度-24h或48h的划痕宽度)/2。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 Res对PASMC的最佳抑制浓度

不同浓度的Res处理低氧条件下的PASMC 24、48 h后，可见Res在25、40、80、100、150、200 μM剂量时对PASMC有明显增殖抑制效应(P<0.05)(表2)，显示Res对PASMC的增殖有一定抑制作用，且抑制作用呈时间、浓度依赖性。依据上述结果选用25、100 μM Res用于后续实验。

Table 2Different concentrations of Res inhibited the proliferation of

#：与Res(0μM)组比较，P<0.05

2.2 Res抑制低氧条件下PASMC OPN mRNA的表达水平

通过低氧条件下低剂量(25μM)和高剂量(Res 100μM)对PASMC干预24、48 h，用qRT-PCR法检测Res对PASMC OPN mRNA表达的影响，发现Res干预组PASMC OPN mRNA的表达量明显低于低氧组(P<0.05)(表3)，说明Res能够抑制PASMC OPN mRNA的表达。

Table 3Relative expression of PASMC OPN

#：与低氧组比较，P<0.05

2.3 Res抑制低氧条件下PASMC OPN 蛋白的表达水平

采用western-blot法检测PASMC中OPN蛋白的表达情况，发现低氧培养24 h和48 h时，Res低剂量(25μM)和Res高剂量组(100μM)干预后PASMC OPN蛋白的表达量明显低于低氧组(P<0.05)，说明Res能抑制低氧条件下PASMC OPN蛋白的表达，且抑制效果与时间相关。

图1PASMC OPN 蛋白表达(24h)图

Figure1PASMC OPN protein expression(24h)

图2 PASMC OPN蛋白表达(48h)图

Table 4Expression amount of PASMC OPN

#：与低氧组比较，P<0.05

2.4 Res抑制低氧条件下PASMC的增殖能力

采用MTS法检测PASMC的增殖情况，发现低氧培养24、48 h时Res高剂量组(100μM)与低氧组比较差异有显著性(P<0.05)，说明高剂量Res能够抑制低氧条件下PASMC的增殖。

Table 5Proliferation of

#：与低氧组比较P<0.05

2.5 Res抑制低氧条件下PASMC的迁移力

通过低剂量和高剂量Res干预PASMC 24、48 h可见，低氧组与常氧组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且低氧组较常氧组平均迁移距离增加，说明低氧能促进PASMC迁移；低氧+Res(25μM)组和低氧+Res(100μM)组与低氧组比较均有统计学差异且均较低氧组平均迁移距离减少(P<0.05)，说明Res能抑制低氧条件下PASMC的迁移。

图3细胞划痕图

Figure3Cell scratch map

Table 6Migration distance of

#：与低氧组迁移距离比较，P<0.05

3 讨论

PAH是由低氧引起的肺动脉内皮细胞功能紊乱、中膜平滑肌细胞增殖和细胞外基质沉积从而导致肺血管收缩、肺动脉阻力增加和血管重塑的一种血管性疾病。已有研究表明，慢性缺氧性PAH病理变化的形成与内源性内皮生长因子-1、血管紧张素Ⅱ、血清素、前列环素、一氧化氮、血小板转化生长因子及细胞与细胞外基质产生的金属蛋白酶等有关[4-6]，但PASMC的增殖、迁移、血管重塑在PAH发生中的确切机制仍不完全清楚。本课题组前期通过慢病毒干扰PASMC OPN的表达观察低氧条件下大鼠PASMC OPN表达以及增殖情况，发现低氧可使OPN表达量增加且低氧能促进PASMC的增殖，干扰OPN基因后可抑制低氧PASMC的增殖[3]。

通过培养PASMC 24、48 h发现，低氧组与常氧组比较，其PASMC OPN的表达量明显增加，说明低氧可诱导PASMC OPN表达增加，与本课题组前期研究[3]以及Irshad K[7]的结果一致，证明缺氧是促进PASMC OPN表达的重要因素。

徐观辉[1]等通过Res对黑素瘤细胞株的干预，发现Res能显著减少黑素瘤细胞株OPN mRNA和蛋白表达。本实验通过Res干预低氧条件下的PASMC，发现Res可明显降低PASMC OPN mRNA和蛋白的表达量，与上述Res能明显抑制OPN mRNA和蛋白表达的结果一致。

陈莉延[8]等通过对低氧加Res组和单纯低氧组大鼠肺动脉压力和肺小血管中膜厚度、面积的检测，发现以低氧加Res行干预处理，其肺动脉压力和肺血管重塑明显轻于单纯低氧组。周志宏[9]等也证明了Res具有抗动脉重塑作用，这说明Res对PAH的形成有抑制作用。目前Res抑制PAH形成的研究大多数围绕大鼠整体水平的研究，Res对PASMC的研究较少报道。有研究证明Res能抑制血管平滑肌细胞的增殖[10]，另外Res对多种肺癌细胞有明显的抑制增殖、侵袭力作用[11-12]，罗猛[13]等进一步研究发现通过抑制OPN基因能降低肺癌细胞侵袭能力，说明OPN对肺癌细胞侵袭能力有重要影响。本实验结果显示Res能降低OPN的表达能力且能抑制低氧条件下PASMC的增殖和迁移，因此Res通过降低低氧条件下OPN的表达而起到抑制PASMC增殖和迁移作用，其具体调控机制需进一步研究。