表皮生长因子受体在胶质母细胞瘤中的表达及其与患者预后的关系*

周修明， 徐静， 陈旭娜， 何桂录， 马宇强， 赵华福， 李维平， 刘文兰， 陈保东△

1安徽医科大学深圳二院临床学院(广东深圳 518035); 2深圳市第二人民医院神经外科(广东深圳 518035)； 3广州中医药大学深圳医院检验科(广东深圳 518034)

胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是预后较差的脑肿瘤之一，具有增殖性强，侵袭性高，及对常规治疗耐受的特点[1]。现如今对于GBM，临床主要通过手术切除肉眼可见范围肿瘤组织，并选择性切除少许临近肉眼正常组织，术后辅以放化疗，靶向治疗等方式对患者进行治疗[2]。然而摆在外科医生面前的一大难题就是GBM患者预后较差，标准治疗方案治疗后中位生存期仍只有14.6个月左右[3]。现在有很多与GBM相关的分子靶向药物被科研人员一一开发，然而目前对GBM更深层次的研究仍然不够充分。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体[4]。研究表明许多实体瘤存在EGFR的异常表达[5]。EGFR与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关[6]。而众多相关的数据都可以在癌症基因组图谱中查到[7]。本研究通过对TCGA数据库中EGFR的表达与GBM患者预后的关系，以及对本院42例GBM样本、2例Ⅰ级胶质瘤和4例对照样本的分析来研究EGFR对GBM患者预后的评估价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究共纳入我院2016年1月至2017年1月42例GBM样本、2例Ⅰ级胶质瘤和4例对照组样本，并从我院病例系统中收集患者年龄、性别、临床症状、切除部位及病理类型的数据。纳入标准：GBM样本选取首次确诊为GBM且经病理证实的患者，Ⅰ级胶质瘤患者选取首次确诊为Ⅰ级胶质瘤且经病理证实的患者。对照组为我院外伤及癫痫患者的病变样本。排除标准：排除儿童患者。肿瘤的病理分型等数据同时由两名神经外科医生独立判断。本研究及收集的患者病理标本由我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 本研究使用Trizol法提取总RNA。先将组织在液氮中能研磨成粉末，再以50～100 mg组织加入1 mL Trizol液研磨。研磨液室温放置5 min，以每毫升Trizol液加入0.2 mL的比例加入氯仿，盖紧离心管后振荡15 s。取上层水相于新离心管，按照每毫升Trizol液加0.5 mL异丙醇比例加入异丙醇，室温放置10 min后12 000×g离心10 min。弃去上清液并按照每毫升Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，混匀后4℃下离心5 min。弃去上清液后室温干燥10 min，再将其溶于水中即为总RNA。

1.2.2 cDNA合成 使用RNA逆转录酶与相应引物，通过oligo(dT)短片段合成cDNA的第一条链。再以mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA的第二条链。将cDNA保存在-80℃冰箱中保存。

1.2.3 实时聚合酶链反应 本实验使用华大基因公司的EGFR引物，正向序列5′-TCCTCGATGAAGCCTACGTGATGG-3′，反向序列5′-AAGCGACGGTCCTCCAAGTAGTT-3′。使用Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂。首先将试剂溶解保存于冰上，在16 μL的单个PCR反应体系中依次加入8 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，6.6 μL PCR等级的水，混匀。将15.6 μL混合液吸取至PCR微孔板中。加入0.4 μL的DNA模板，小心混匀。将微孔板置于real-time PCR 7500仪器中，95℃变性15 s，60℃退火并延长1 min，完成40个循环，同时检测引物效率。

以EGFR为目的基因，GAPDH为内参基因。计算基因差异表达的倍数，计算公式为2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。将PCR结果中2-ΔΔCt值>2设置为EGFR高表达组，2-ΔΔCt值≤2设置为非EGFR高表达组。

1.2.4 TCGA数据库样本筛选 TCGA数据库中筛选2017年当年录入患者，年龄>25岁，且为初发GBM，对录入的患者进行EGFR关联蛋白网络、拷贝数、无进展生存期和总生存率的分析。

1.3 统计学方法 使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6.0软件分析实验结果。通过非配对t检验评估表达差异性，Pearson2检验和连续性校正的2检验比对临床数据特征，log-rank检验评价生存曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBM患者临床病理特征与EGFR表达的相关性分析 按照年龄、性别、是否存活及是否复发分组，EGFR高表达组与低表达组现存活患者生存期均值分别为26.1和27.1个月，死亡患者生存期均值分别为18.7和13.0个月。分析后发现EGFR高表达组和非高表达组与年龄、性别、存活和复发均无关(P>0.05)。见表1。

表1 GBM患者临床病理特征与EGFR表达的相关性例

2.2 44例GBM患者EGFR的PCR结果及分析 4例对照组的2-ΔΔCt值均<6，GBM样本的2-ΔΔCt值分布在0～500范围内。GBM组2-ΔΔCt值均值明显高于对照组(图1)。根据先前收集的患者资料及随访结果，对患者的生存时间进行统计(图2)，但可能由于手术效果及样本量原因，本院患者生存时间明显高于数据库中的14个月平均生存期，而从两组生存时间差异角度比较，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 GBM患者EGFR的表达

2.3 TCGA数据库中EGFR表达情况及其关联网络 本研究筛选TCGA数据库中520个样本的EGFR mRNA表达情况进行分析。二倍体几乎无突变，相比之下高表达的样本中有大量错义突变(图3)。EGFR与BIK3CA、PTEN、LAT2、P3GFA、FGF6、STAT6、EPHB3、AP2M1、SH3GL2、ACTA2、FGF23、CPSF6、LAT2等蛋白有紧密联系(图4)。

图2 44例GBM患者的生存曲线

图3 TCGA数据库中EGFR拷贝数变化

2.4 TCGA数据库中EGFR表达与预后的关系 根据TCGA数据库资料分析得出，GBM平均存活时间只有14个月，无论是EGFR高表达还是非高表达，30个月后其生存率已非常低，在纳入分析的TCGA数据库的520个病例中，402例患者已死亡。而通过对TCGA数据库中两组总生存率对比，EGFR高表达组明显低于非EGFR高表达组(log-rank检验P=0.003 64)。然而，对于无进展生存时间差异的分析发现，两组之间无进展生存时间之间差异无统计学差异(log-rank检验P=0.163)(图5)。

图4 TCGA数据库中EGFR关联蛋白网络

A：总生存曲线；B：无进展生存曲线

2.5 本组病例与TCGA数据库数据对比 通过对我院44例GBM的分析，进一步证实了520例TCGA数据库中EGFR在GBM中高表达的结果。但在生存期方面，由于样本量有限，暂时没有未发现差异有统计学，而TCGA数据库中两组总生存率对比，EGFR高表达组明显低于非EGFR高表达组(log-rank检验P=0.003 64)，无进展生存时间差异无统计学意义(log-rank检验P=0.163)。

表2 TCGA数据库中EGFR高表达组与非高表达组中位生存期

3 讨论

目前临床对于GBM患者采用以手术切除为主，放化疗为辅的综合治疗方法[8]。然而，虽然GBM患者的中位生存期得到延长，但近年来仍未发现更好的治疗方法[9]。现如今，分子靶向治疗和免疫治疗在临床越来越受到重视，但临床实际开展的项目较少[10]。我院针对少量GBM患者开展CAR-T治疗，其疗效正进一步观察中。

EGFR在许多实体瘤异常表达，其与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关[11-12]。本研究旨在探索EGFR作为胶质瘤的致病因素，在肿瘤的发生发展过程中起关键作用。在TCGA数据库中我们研究了520例胶质瘤患者，对他们已录入TCGA数据库的数据进行分析，并在本院40余例临床标本中进一步证实。除了GBM患者的样本分析，本实验室在其他级别胶质瘤中也对EGFR进行初步分析，发现其表达可能与胶质瘤级别相关。目前，GBM根据基因表达谱可以分为4型：前神经元型(26%)、神经元型(17%)、经典型(27%)及间质型(29%)[13-14]。不同分型预后不同，而在不同分型中EGFR的表达水平也不尽相同，这提示GBM中EGFR的表达可能与不同分子分型及预后相关[15]。TCGA数据库中对于不同EGFR扩增水平的患者标本进行分析，发现EGFR高表达组，其患者预后要明显差于非EGFR高表达组，这提示EGFR表达与患者预后相关。而针对这一改变，可能是EGFR的扩增使其蛋白表达水平升高，进而影响下游相关信号通路，从而对GBM的生长、侵袭、迁移和凋亡等细胞过程产生决定性影响。从本研究的分析来看，EGFR与BIK3CA、PTEN、LAT2、P3GFA、FGF6、STAT6、EPHB3等密切相关，因此与之相关的蛋白可能是EGFR上下游的信号通路上的蛋白[16]，后续进一步的研究可以从这一系列蛋白着手，例如EGFR的扩增通常伴随着PTEN的扩增，那么二者之间是否有相应信号通路相互作用，影响GBM的生长、凋亡与耐药等。

我院近年来收治了非常多的胶质瘤患者，通过不断对患者术后情况进行随访以及对患者术后标本的分析研究，以期能进一步探寻GBM的分子机制和关键靶点。GBM是胶质瘤中恶性度最高，预后最差，平均生存期最短的肿瘤。本研究对44例GBM的分析，与TCGA数据库中EGFR在GBM中高表达的结果基本一致，但在生存期方面，由于样本量有限，暂时没有发现统计学上的差异。

总而言之，EGFR在GBM中异常表达，且作为独立因素对患者预后有明显影响。因此EGFR可能在GBM中起到至关重要的作用，而以EGFR蛋白及其相互关联蛋白为突破口，可以进一步对GBM的发生发展有更进一步的了解，并通过对其分子机制的进一步研究来改变其迁移、侵袭及耐药等特性，以期望能找到更好的治疗方法并有效改善胶质瘤患者预后。