水飞蓟宾单用及合用肝龙含药血清对HSC的影响及机制研究

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1.大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000

肝纤维化是由于各种原因导致的慢性肝损伤过程，可使以胶原蛋白为主的细胞外基质(Extracellular matrixc, ECM)在肝脏中大量沉积。肝纤维化如果没有及时有效的治疗，可进一步发展为肝硬化，并诱发肝细胞功能障碍及门静脉高压等一系列并发症，严重则可能导致肝癌的发生[1]。但是肝纤维化是可逆的，及时阻止或逆转肝纤维化的发生和发展，是防治肝硬化和慢性肝病，提高肝病患者的生命质量和生存率的关键。研究发现，肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSC)的活化增殖是肝纤维化发生、发展的重要环节，HSC被激活后可转化为肌成纤维细胞，并诱导促纤维化细胞因子的分泌，增加胶原的合成，从而导致肝纤维化的发生[2-5]。Ca2+对细胞生理活动起到极其重要的调节作用，细胞内Ca2+浓度的增加是细胞增殖分裂的必要条件[6-7]。在HSC活化过程中，细胞内Ca2+是诸多生长因子、氧化应激产物及细胞因子等发挥促生长和增殖作用的主要介质之一，因此通过测定HSC内Ca2+浓度可以间接了解其生长情况。

近年来许多药物如秋水仙碱、还原型谷胱甘肽、水飞蓟宾等都被用于肝纤维化的治疗，但临床效果却不理想[8]。水飞蓟宾(Silybin, SF)是水飞蓟素中含量最高、活性最强的成分，因其具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等药理作用，临床广泛用于各种肝胆疾病的治疗[9-10]。研究发现，美洲大蠊提取物具有促进组织修复、消炎止痛、抗肝纤维化和抗肿瘤,增强免疫活性等药理作用[11-12]。肝龙胶囊(Ganlong capsule, GL)是从美洲大蠊中提取的以粘糖氨酸和复合核苷类为主要成分的抗肝炎新药[13]，具有疗效确切不良反应少等优点，现在已经广泛用于临床实践。本课题组前期研究发现，单用水飞蓟宾对HSC的抑制作用不如水飞蓟宾联合肝龙。含药血清经过了机体代谢可以更好的模拟药物的最终有效成分，更接近药物在体内的药理效应，从而可以更准确的研究其药理机制。本研究选用大鼠HSC，分别给予水飞蓟宾单用及水飞蓟宾联合肝龙含药血清处理，观察其对HSC增殖活性的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料 SD雄性健康成年大鼠，体重(180±20) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证：SCXK(湘)2011-0003；大鼠肝星状细胞(HSC-T6)购自中科院昆明细胞库(编号:KCB200703YJ)。

1.1.2 药物与试剂 水飞蓟宾胶囊(批号：16041601，天津天士力圣特制药有限公司)；肝龙胶囊(批号：550706087，昆明赛诺制药有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；噻唑蓝(MTT)、Hepes(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；碳酸氢钠(天津市风船化学试剂科技有限公司)；Fluo-3/AM(美国Millipore公司)。

1.2 仪器与设备 二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific)；CKX41倒置显微镜(日本Olympus)；离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 含药血清的制备 SD雄性大鼠随机分为肝龙组(150 mg/kg)，水飞蓟宾组(28 mg/kg)及空白对照组(0.9% NaCl溶液),按1 mL/100g给药容量，每天灌胃一次，连续灌胃7 d，最后一次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃给药1 h后，用异氟烷麻醉腹主动脉取血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，静置4 h，3000 r/min离心10 min,分离血清，经56 ℃恒温灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜除菌，-20℃保存备用。

1.3.2 HSC-T6细胞培养及药物分组 从-80 ℃超低温冰箱取出HSC-T6细胞，用含有10%胎牛血清和1%青链霉素抗生素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2条件下进行培养，待细胞融合率达80%～90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，实验时选取对数期生长良好的细胞。根据水飞蓟宾含药血清(7.5%、15%、30%)及肝龙胶囊含药血清(7.5%、15%、30%)进行2因素3水平完全实验设计，同时设空白血清对照组，水飞蓟宾及肝龙胶囊含药血清浓度编号见表1。

表1 水飞蓟宾及肝龙胶囊含药血清浓度编号

1.3.3 MTT法检测水飞蓟宾单用及联合肝龙含药血清对HSC增殖的影响 用0.25%的胰酶将处于对数生长期的HSC-T6细胞消化后，用细胞计数板对细胞进行计数，使细胞密度为6×104个/mL接种于96孔板，细胞悬液终体积为100 μL，置于37 ℃、5% CO2条件下进行无菌培养24 h，待细胞生长旺盛贴壁后更换不同浓度含药血清的培养基及空白培养基，每组设3个复孔，分别培养24、48、72 h。弃去旧培养基用PBS小心清洗2遍，将20 μL浓度为5 mg/mL的MTT依次加入各孔，继续在37 ℃、5%CO2条件下培养4 h，之后每孔分别加入150 μL的DMSO，充分振荡，使甲臜充分溶解，用多功能酶标仪在490 nm波长处检测其吸光度值(A490)。

细胞存活率=(OD药物组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)；

细>胞>抑>制>率>=1-(OD药物组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)。

1.3.4 激光扫描共聚显微镜检测细胞内游离Ca2+的浓度 根据水飞蓟宾单用及联合肝龙含药血清对HSC增殖作用的影响发现，30%水飞蓟宾联合不同浓度肝龙含药血清对HSC的抑制作用较好，故本次研究用激光扫描共聚显微镜检测其对细胞内游离Ca2+浓度的影响。将培养的细胞取出，弃去含胎牛血清培养基，用HBSS溶液洗涤细胞至少3次；在每孔细胞中加入30 μL Fluo 3-AM工作液；37 ℃、5% CO2细胞培养箱内孵育30 min，之后除去工作液,为充分洗去工作液，加入HBSS溶液清洗细胞3次，然后每孔加入20 μLHBSS溶液覆盖细胞；37 ℃、5% CO2细胞培养箱内孵育约25 min后，用激光共聚焦显微镜来检测细胞内Ca2+的浓度。设置扫描条件：20×倍镜下、激发波长488 nm、发射波长525 nm，10%激光强度、PMT(1100)。计算整个细胞的平均荧光强度，记录荧光强度的相对值(%)以观察Ca2+浓度动态变化。计算公式：Ca2+浓度=Kd( F-Fmin)/( Fmax-F)。(F：实时荧光强度；Fmax：0.1%TritonX-100 测得的荧光强度值；Fmin：5 mM EGTA 测得的荧光强度值；Kd =400 nmol/L)[14]。

2 结果

2.1 水飞蓟宾单用及联合肝龙含药血清对HSC增殖的作用 不同浓度水飞蓟宾单用及联合不同浓度肝龙含药血清分别作用HSC24、48和72 h，单用7.5%和15%水飞蓟宾含药血清组对HSC的增殖作用不明显(P>0.05)，单用30%水飞蓟宾含药血清处理24 h时，其抑制率为16.5%；水飞蓟宾联合肝龙含药血清组对HSC抑制作用显著高于单用水飞蓟宾含药血清组(P<0.01)。见表2。

表2 水飞蓟宾单用及合用肝龙含药血清对HSC增殖的影响

注：与单用水飞蓟宾含药血清组相比，▲P<0.01。

2.2 30%水飞蓟宾单用及联合肝龙含药血清对HSC内Ca2+浓度的影响 在单独用药情况下：与空白血清组相比，水飞蓟宾组HSC内Ca2+浓度在24、48、72 h分别降低27.80%、67.06%、50.70%；联合用药时：与单用水飞蓟宾含药血清组相比，水飞蓟宾+7.5%肝龙组HSC内Ca2+浓度在24 h时一过性增加，随着作用时间的延长，在48 h时HSC内Ca2+浓度降低26.49%，在72 h 时HSC内Ca2+浓度增加29.34%；水飞蓟宾+15%肝龙组HSC内Ca2+浓度在24、48、72 h分别降低13.46%、29.34%、36.49%；水飞蓟宾+30%肝龙组HSC内Ca2+浓度在24、48 h分别增加0.78%、26.77%，在72 h降低15.97%。如图1所示。

3 讨论

近年来我国肝硬化、肝癌的患病率居高不下，肝纤维化作为这两大疾病的必经阶段,是一个可逆的过程。本研究以大鼠为实验对象，研究水飞蓟宾单用及联合肝龙含药血清在体外对HSC增殖活性的影响，结果表明水飞蓟宾联合肝龙含药血清对HSC的抑制作用强于单用水飞蓟宾,随着对肝纤维化机制的深入研究发现，正常肝细胞经酒精、病毒、药物等作用损伤，产生炎症，刺激并激活HSC，激活的HSC转化为肌成纤维细胞，进一步诱发促纤维化细胞因子分泌和增加胶原的合成，使细胞外基质过量产生，引起肝纤维化[2-3]。HSC在肝纤维化发生发展过程中的增殖能力明显增强。因此认为可以通过抑制HSC的活化和增殖来逆转肝纤维化。

通过激光共聚焦测定HSC内Ca2+浓度发现，与单用水飞蓟宾相比，肝龙联合水飞蓟宾含药血清在一定程度上可使细胞内游离Ca2+浓度明显降低，其中水飞蓟宾联合15%肝龙含药血清时，HSC内游离Ca2+浓度降低最为明显。细胞内Ca2+浓度与HSC生长和增殖作用密切相关，它能参与诸多细胞因子、生长因子及氧化应激产物等对HSC的调控。这些因子通过增加细胞膜钙通道活性，促进Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度增加，引起HSC的收缩和有丝分裂[7]。并且，已有研究表明[15]大鼠HSC内Ca2+浓度增加会引起HSC收缩。值得注意的是，与单用水飞蓟宾组相比，水飞蓟宾联合肝龙含药血清作用HSC 24、48 h，在肝龙含药血清浓度为15%时可降低HSC内游离Ca2+浓度，而在肝龙含药血清浓度为30%时可增加HSC内游离Ca2+浓度，在一定程度上表现出肝龙对HSC内游离Ca2+具有双向调节作用。推测肝龙对Ca2+的抑制与促进作用可能与药物浓度、作用时间和药物的体内代谢有关，而对不同疾病还需要考虑病情来选择最佳给药剂量，但这还有待进一步研究。

综上所述，肝龙能够增强水飞蓟宾含药血清对HSC的抑制作用，从而达到增强在体外的抗肝纤维化的作用，其作用机制可能与调控细胞内Ca2+浓度有关。但本次实验尚存在许多不足，本研究所用的细胞为大鼠肝星状细胞，与人源细胞存在一定的种属差异，因此下一步可以选用人源细胞作为实验对象来加以证实，同时对肝龙的体内药物代谢动力学进行研究，为临床水飞蓟宾和肝龙胶囊的联合应用提供更充分的依据。