院内多重耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学特征研究

刘丽娟 陈金之 张志军 姜梅杰,*

(1 莱芜市人民医院检验科，莱芜 271100；2 泰安市中医医院检验科，泰安 271000；3 泰安市中心医院检验科，泰安 271000)

鲍曼不动杆菌已成为院内感染的重要病原菌之一。2012—2016年非发酵糖革兰阴性菌中，鲍曼不动杆菌分离率一直位居第一位[1-5]。Ying等[6]报道华南7个地区146株多重耐药鲍曼不动杆菌，主要是ST208，其次是ST191和ST729。Li等[7]报道17株MDRAB和35株XDRAB中，ST195可能是中国广州最常见的ST。Ning等[8]报道2009年6月—2014年11月中国北京101株MDRAB中，主要是ST191和ST195。因此不同地区、甚至不同医院分离MDRAB主要流行的序列类型及耐药性基因也不完全相同。为探明MDRAB在医院内传播的原因，预防MDRAB在医院内发生克隆株流行，我们对该院4年间MDRAB分子流行病学特征进行了研究。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2013—2016年间莱芜市人民医院住院患者标本中分离出的51株MDRAB，其中34株来自重症监护病房(ICU)的患者，10株来自神经外科病房的患者，7株来自神经内科病房的患者。50株标本来源于痰液，1株来源于尿液。

1.2 细菌鉴定及药敏试验

采用BD凤凰phoenixTM100 NMIC/ID-4复合板鉴定菌种及药敏试验，同时用K-B纸片扩散法检测头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素的敏感性，药敏试验执行最新版的美国临床实验室标准化研究协会(CLSI)标准。其中替加环素敏感性试验执行FDA的标准，头孢哌酮/舒巴坦敏感性试验执行CLSI中头孢哌酮的标准。MH琼脂和药敏纸片均为英国Oxoid产品。MDRAB的判断标准是根据Magiorakos等[9]报道的标准进行判断。铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218作为质控菌株。

1.3 耐药基因检测

采用煮沸法提取细菌DNA模板，碳青霉烯酶类相关耐药基因采用多聚酶链反应(PCR)方法。PCR反应体积为50μL，含H2O 31.75μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTPs MIX(10mmol/L) 4μL，正反向引物各2μL，1.25UTap酶，10～100ng DNA模板5μL。PCR扩增仪使用MJ-PTC-100(BIO-RAD)。退火温度参照文献[10]。碳青霉烯酶类相关耐药基因引物参照文献文献[10]，blaNDM-1基因PCR扩增引物序列参照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所公布的引物序列。

1.4 多位点序列(MLST)基因分型

参照Bartual等[11]方法进行检测分析。对鲍曼不动杆菌的7个管家基因进行序列扩增并测序，将测序结果在鲍曼不动杆菌MLST数据库(http://pubmlst.org/abauniannii/)中进行BLAST比对分析，得到每个管家基因对应的等位基因编号。然后将gltA-gyrB-gdhBrecA-cpn60-gpi-rpoD这一组管家基因编号的组合称为管家基因谱，每一个编号的组合对应一个序列型(sequence type,ST)。与MLST数据库中已有管家基因谱进行比对，得到每株细菌对应的ST型。

1.5 DNA测序

随机取不同MLST的阳性基因进行测序，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序(ABI3730XL全自动DNA测序仪)，测序结果在GenBank网上查询。

1.6 统计分析

用WHONET5.6软件对临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌进行筛选,所有筛选出的菌株数据用WHONET5.6软件进行耐药性分析。

2 结果

2.1 药敏试验结果

51株MDRAB对哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、复方磺胺甲噁唑、四环素、左氧氟沙星和环丙沙星耐药率为100%(51/51)；对美罗培南和亚胺培南的耐药率为94.1%(48/51)；对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为84.3%(43/51)和90.2%(46/51)；对头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素的耐药率分别为62.7%(32/51)和23.5%(12/51)；对多黏菌素B 100%敏感。

2.2 碳青霉烯酶相关耐药基因检测及测序结果

51株MDRAB中，blaOXA51基因都阳性(图1)，48株(94.12%)blaOXA23组基因阳性(图2)。随机取不同MLSTblaOXA51阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果均为blaOXA51型碳青霉烯酶基因(图3)。随机取不同MLSTblaOXA23组阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果均为OXA23型碳青霉烯酶基因(图4)。未检出blaIMP、blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-24、blaOXA-48、blaOXA-50、blaOXA-55、blaOXA-58和blaOXA-60碳青霉烯酶基因。

2.3 MLST分子分型结果

将51株MDRAB进行MLST分子分型，结果发现有3种STs，依次为ST191(52.94%)、ST208(31.37%)和ST136(15.69%)，均属于克隆复合体CC92。本文收集的样本中，序列型ST191和ST208是主要的序列类型，其次是ST136。4年间ST208在医院内持续性的播散，ST191和 ST136在不同时间段间断性的播散在该医院4年间51株MDRAB 3种STs分型结果及碳青霉烯酶阳性基因的分布情况见表1。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是院内常见的非发酵革兰阴性菌之一。已有报道多重耐药鲍曼不动杆菌主要引起下呼吸道感染[12]，主要分布在重症监护病房[13-14]。该院2013—2016年间临床分离的51株MDRAB中，50株标本来源于患者的痰液，34株标本来源于重症监护病房(ICU)，说明MDRAB主要引起呼吸道感染并且分布在ICU患者。

图1 blaOXA51基因PCR产物电泳图Fig.1 blaOXA51 genes PCR results electropherogram

图2 blaOXA23基因PCR产物电泳图Fig.2 blaOXA23 genes PCR results electropherogram

图3 blaOXA51基因测序图Fig.3 blaOXA51 genes sequencing diagram

图4 blaOXA51基因测序图Fig.4 blaOXA23 genes sequencing diagram

已有报道鲍曼不动杆菌携带blaOXA-23型碳青霉烯酶与碳青霉烯类耐药相关[15-17]。本研究51株MDRAB均携带blaOXA-51型碳青霉烯酶基因，48株携带blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB对亚胺培南和美罗培南都耐药，3株未检出blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB对亚胺培南和美罗培南都敏感，对头孢吡肟、头孢他啶、头孢塞肟、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦都耐药，说明blaOXA-23型碳青霉烯酶与亚胺培南和美罗培南耐药密切相关，这与有关报道相一致[15-17]。

不同地区院内分离的MDRAB主要流行的序列类型及耐药性基因也不完全相同[6-8]。本研究分析发现，在收集的样本中，序列类型ST191(52.94%)和T208(31.37%)是主要的序列类型，其次是ST136(15.69%)，均属于全球流行的CC92克隆群，其祖先ST型为ST92，与国内外的研究类似[18-19]。虽然CC92克隆复合体在全球流行，但不同地区的流行株仍各有其特点，这可能不同地区的抗生素使用习惯等环境选择压力影响ST92的遗传方向而造成的后果。表1显示，该院4年间ST208型产blaOXA-23型酶基因的MDRAB在院内持续性的播散，ST191型MDRAB在2013年、2014年和2015年检出，但在2016年筛选出的12株MDRAB中未检出ST191型MDRAB，说明该院ST191型MDRAB在院内可能存在间断性的播散。我们的研究仅在2016年筛选出的12株MDRAB中检出了ST136型产blaOXA-23型酶基因的MDRAB，在2016年未检出ST191型MDRAB，说明该院MDRAB流行菌株可能有变化。本研究发现该院发生过克隆株的流行。因此医院感染控制部门要进一步关注医院内耐药菌的传播，这对医院感染控制是非常有帮助的。

表1 51株MDRAB STs分布及碳青霉烯酶阳性基因分布情况Tab.1 Distribution of fifty-one MDRAB STs strains and carbapenem positive gene

本研究51株MDRAB中，有3株对亚胺培南和美罗培南敏感(这3株是ST191型未检出blaOXA-23型酶基因的MDRAB)，其余48株耐药。1株对头孢哌酮/舒巴坦敏感、18株中介、32株耐药，27株对米诺环素敏感、12株中介、12株耐药，对多黏菌素B都敏感，对头孢他啶等10种抗菌药物都耐药。因此临床医师治疗MDRAB引起的感染必须根据药敏结果选用抗菌药物。

综上所述，该院临床4年间分离的MDRAB存在克隆株的流行，医院应进一步加强消毒隔离措施，防止院内多重耐药鲍曼不动杆菌的暴发流行。