生防细菌对松材线虫灭杀效果初步研究

王义勋 徐小文 祁高富 侯珊珊 许秀环蔡明乾 朱红军 陈京元

(1.湖北省林业科学研究院 武汉 430075； 2. 华中农业大学 武汉 430070； 3. 武汉市林业科技推广站 武汉 430024； 4.保康县林业局 十堰 441600)

松材线虫病(又称松树萎蔫病)是松树上的一种极具毁灭性的病害，是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的我国目前危害最严重的检疫性病害之一[1]。敏感型松树感染松材线虫后，最快的40多天即可枯死[2]。松材线虫的寄主高达数十种，其蔓延迅速，发生面积不断扩大，危害程度不断加重，对我国的松树资源、自然景观和生态环境构成了严重威胁[3]。近年来，在湖北省境内，松材线虫病大面积发生，疫情日趋严重，对我省的松树资源造成了巨大的威胁。在这种形势下，找到新型高效的防控措施成为迫切的需要。松材线虫的防治对于控制松材线虫病起着至关重要的作用，随着该病害的日益蔓延，利用高效、低毒、选择性好的生物防治方法来防控松材线虫病成为研究的热门。在前期的研究中，笔者发现了10株对根结线虫具有良好防治效果的生防菌，本研究以这10株生防菌为实验材料，展开了室内和林间的杀虫活性实验测定，为松材线虫病生物防治试剂的选择扩增了范围，也为寻找潜在的有效生防菌株提供了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为本实验室保存的10株对根结线虫有较好防治效果的生防菌株(菌株编号分别为A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)。松材线虫和灰葡萄孢菌均由南京林业大学提供。松材线虫的保存方法参见文献[4]。

1.2 培养基和抗生素

1.8 % 水琼脂培养基：琼脂18 g ，去离子水定容至1 000 mL，高压蒸汽灭菌后使用。

M9缓冲液：Na2HPO4·7H2O 5.8 g，KH2PO43.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水定容至1 L，高压蒸汽灭菌后加入终浓度为0.1 mg/mL MgSO4·7H2O使用。

链霉素：溶解0.1 g链霉素于足量的蒸馏水中，最后定容至10 mL。以100 mg/mL的终浓度添加于细胞培养板中，用于抑制杂菌的生长。

氯霉素：溶解0.02 g胆固醇于足量的无水乙醇中，蒸馏水定容至10 mL。以2 mg/mL的终浓度添加于细胞培养板中，用于抑制杂菌的生长。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵液的制备

在超净工作台将培养好的供试菌株分别接种于装有 250 mL LB液体培养基的三角瓶中，置于摇床上(37 ℃，180 r/min )振荡培养 48 h，获得发酵液。

1.3.2 提取菌株活性成分

将上述得到的生防菌株发酵液用等体积石油醚萃取三次，合并萃取物，50℃旋转蒸发干燥，得到的干燥物用无水乙醇溶解。

1.3.3 线虫的培养

将灰葡萄孢菌接种到PDA培养平板上，放置于25℃培养箱中培养至菌丝长满全皿。在超净工作台中将松材线虫接种于灰葡萄孢平板上，于25℃培养 10 d。采用贝尔曼漏斗法分离线虫，10 h后将收集得到的线虫液在离心机中离心(4 000 r/min，5 min)去掉杂质后，用M9缓冲液稀释线虫液，重复3次，最后收取到线虫液。

1.3.4 10株生防菌株对松材线虫杀虫活性测定

将对根结线虫有较好防治效果的10株生防菌(编号分别为A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)，发酵48 h后离心，10 000 rpm, 20 min,取上清液，稀释不同的浓度，包括上清原液、稀释2倍、稀释10倍、稀释50倍等浓度梯度，对松材线虫进行室内防治试验。向96孔细胞培养板每个孔里依次加入3 μL氯霉素(2 mg/mL)，1 μL链霉素(100 mg/mL)，处理组加入200 μL 不同浓度上清液，对照组加入200 μL M9缓冲液，最后加入30条左右的松材线虫，每个处理设三个重复，24 h后观察并计算松材线虫线虫致死率。

1.3.5 菌株A4发酵乙醇抽提物对松材线虫LC50值测定

选取室内杀虫活性最好的A4菌株为试验对象。先用M9缓冲液将培养好的松材线虫洗入离心管中制成虫液，向1.5 mL的离心管中加入0.5 mL 1.8%的水琼脂，待其凝固后加入1ul松材线虫液(约30条)，在离心管盖上放入圆滤纸片，分别向滤纸片上滴加浓度为0.168 、0.252、0.336、0.418、0.502、0.585、0.669、0.752、0.836 mg/mL的A4发酵乙醇抽提物各1 μl，以等量无水乙醇为对照。用封口膜将其密封后，避光放置于20 ℃培养箱，24 h后测定A4发酵乙醇抽提物熏蒸杀虫活性。

1.3.6 菌株A4发酵乙醇抽提物在林间的杀虫活性测定

将菌株A4经48 h发酵后得发酵液10 L，发酵液用乙醇抽提后用于林间试验。选择武汉蔡甸区和江夏区2个试验点，共1.6 hm2的松林进行松材线虫病防治试验。蔡甸区试验地 0.8 hm2，为马尾松纯林，其中防治区0.5 hm2，对照区0.3 hm2；江夏区试验地0.8 hm2，为马尾松纯林，其中防治区0.5 hm2，对照区0.3 hm2。在2018年5月施药，10月调查林间发病情况，统计松材线虫病枯死株数，计算防治效果。

2 结果与分析

2.1 10株生防菌株对松材线虫杀虫活性测定

室内杀虫活性测定实验结果显示，10株生防菌株的发酵原液对松材线虫均有很好的杀虫活性；当将原液稀释2倍后，菌株A4、A15、B3、B9、D1、D4仍然具有大于50%的杀虫活性；当将原液稀释10倍后，菌株A4的杀虫活性依然高于50%(图1)，此结果表明菌株A4具有更好的室内杀虫活性。

图1 10株生防菌不同浓度梯度发酵液对松材线虫杀虫活性的测定

2.2 菌株A4发酵抽提物对松材线虫LC50值测定

菌株A4发酵乙醇抽提物对松材线虫的致死率见表1。由DPS软件计算得出回归方程为y=6.75x+8.61，相关系数R2= 0.978，LC50值为0.291 mg/mL。在光学显微镜下观察松材线虫的形态，发现与正常的活体虫态相比，经发酵液处理后的松材线虫虫体僵直，体内出现异常泡状物。该实验表明菌株A4的发酵液对松材线虫的致死中浓度是0.291 mg/mL，能够作用于松材线虫，起到杀死虫体的效果。

表1 菌株A4发酵抽提物对松材线虫LC50值测定

2.3 菌株A4发酵抽提物在林间的杀虫活性测定

由表2可知，在蔡甸，防治区的松树枯死率为3.33%，对照区的则为7.00%，与对照区相比，防治区的松树枯死率下降了52.43%；在江夏，防治区的松树枯死率为2.00%，对照区的为5.00%，与对照区相比，防治区的松树枯死率下降了60.00%，该结果表明，菌株A4的发酵乙醇抽提物在林间有较好的防治效果，能够有效降低林间的松树枯死率，为松材线虫病林间防治工作提供了数据参考。

表2 菌株A4发酵抽提物对松材线虫病防治效果

3 结论与讨论

生物防治由于具有对环境友好，不易产生抗药性和防治效果较好等优点，已成为病害防治研究热点。生物防治在松材线虫病的定义上是指通过引入能够捕食线虫或者产生毒素杀死线虫或使得线虫的致病力显著降低的生物来达到有效降低病害的手段[5,6,7]。当前被用来进行植物线虫防治的生物包括真菌、细菌、病毒、捕食性线虫、昆虫和螨类等[8,9,10]，其中细菌由于具有易培养、繁殖速度快等优点，在松材线虫的生物防治中占有重要的地位[7]。据现有报导显示，对线虫有拮抗活性的细菌种类包括有芽孢杆菌类、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌和根际细菌等[11,12]。

本研究的实验对象即为10株对根结线虫有较好拮抗作用的生防细菌，室内杀虫活性测定实验结果表明这10个菌株的发酵原液都具有很好的杀虫效果，当将发酵液稀释2倍、10倍后仍然有菌株表现出较好的拮抗活性，其中菌株A4在发酵液被稀释10倍后仍然具有大于50%的杀虫活性，说明该菌株有很好的生防潜力。经显微结构观察和16SrDNA测序鉴定后发现该菌株为短小芽孢杆菌。芽孢杆菌类细菌对松材线虫具有杀虫活性的报导已屡见不鲜，徐华潮等发现苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白对松材线虫有很好的杀虫活性[13]。郝颖等研究表明一株蜡状芽孢杆菌能够通过分泌具有热稳定的活性物质来杀死线虫[14]。朱丽梅等筛选到1株解淀粉芽孢杆菌，其发酵液的杀线虫活性即使在稀释10倍后仍然高达98.5%[15]。牛秋红等从土壤分离得到的芽孢杆菌NS-3，其培养滤液的杀虫活性不高，但滤液的蛋白粗提物却具有很好的杀虫活性[16]。这些研究结果表明芽孢杆菌类细菌在松材线虫的生物防治方面占有相当的比例，同时不同种类的芽孢杆菌其杀线虫的作用机理也有差别，有的活性物质存在于发酵滤液中，有的存在于蛋白粗提物中，表明作用于松材线虫的有效物质可能是芽孢杆菌分泌的毒素或者某些蛋白酶类。在本研究中，将被杀死的线虫在显微镜下观察其生理结构，发现虫体内部出现空泡，其头部、体壁和尾部均有损伤，提示菌株A4的活性物质能够造成线虫内容物的消解，但具体的作用机理和活性物质的种类鉴定还需要进一步的实验探索。

在菌株A4发酵抽提物的林间防治试验中，与对照区相比，防治区的松树枯死率明显降低，表明该活性物质在林间性质稳定，能够起到较好的防治作用。林间防效通常会受到林间因子，如温度、湿度、林分特点等，以及施药方式、施药浓度、施药频率等因子的影响，而本研究仅初步测定了其林间防效且防治区域有限，尽管取得了较好的防治效果，仍需进一步优化其生产工艺，在推广运用前还需开展更加细致地林间试验。