MMP-7、SDC-1在炎症性肠病中的表达及其意义*

耿 丽 王许平 杨贝贝 王丹丹 高 闯 杜晓博 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科 吴阶平医学基金会中国炎症性肠病联盟 河南省炎症性肠病中心(450014)

背景：基质金属蛋白酶-7(MMP-7)是MMPs家族中的一员，可表达于多种器官受损的黏膜上皮细胞中。多配体蛋白聚糖-1(SDC-1)是MMP-7的作用底物之一，在促进组织修复、维持肠屏障功能等方面发挥重要作用。目的：探讨MMP-7和SDC-1在炎症性肠病(IBD)中的表达及其意义。方法：收集郑州大学第二附属医院2017年1月—2018年1月住院活动期IBD患者的肠组织标本45例和外周血标本50例，同期非IBD肠组织标本30例和外周血标本35例作为对照组。采用免疫组化法检测肠组织MMP-7、SDC-1表达，ELISA法检测血清SDC-1含量。结果：MMP-7在IBD患者的肠组织中呈高表达，特别是溃疡边缘的肠上皮细胞。与对照组相比，IBD患者肠组织MMP-7表达增高、SDC-1表达降低，血清SDC-1含量增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关系数分析显示，肠组织MMP-7表达与IBD疾病活动度呈显著正相关(溃疡性结肠炎：rs=0.519, P<0.05；克罗恩病：rs=0.583, P<0.05)，与肠组织SDC-1表达呈显著负相关(rs=-0.646, P<0.05)。结论：MMP-7在IBD患者肠组织中表达增高，通过剪切SDC-1影响受损肠组织修复，参与IBD的发生、发展。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因不明、反复发作的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)，目前认为其发生主要与遗传易感性、肠道内环境以及宿主不恰当的免疫应答有关。

基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)又称基质溶解素(matrilysin)，是MMPs家族中相对分子质量最小的一员。MMPs是一类普遍表达的锌依赖性内肽酶，底物特异性广泛，除剪切细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的蛋白质和蛋白多糖组分外，MMPs还可剪切多种非基质底物，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、生长因子受体和细胞表面黏附受体[1]。生理情况下，ECM组分的合成和降解处于平衡状态，病理状态下，这一平衡被打破，可能导致溃疡和纤维化发生[2]。多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1, SDC-1)属于Ⅰ型跨膜蛋白，是MMP-7的作用底物之一，在促进组织修复、维持肠屏障功能等方面发挥重要作用[3-4]。本研究通过检测MMP-7、SDC-1在活动期IBD患者肠道和外周血中的表达，旨在探索两者在IBD发生、发展中的作用及其临床意义。

材料与方法

一、标本来源

收集郑州大学第二附属医院2017年1月—2018年1月住院IBD患者的肠组织标本45例(取自病变最明显处)和外周血标本50例。入组病例诊断符合2018年《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》[5]，UC和CD疾病活动性的评估分别采用改良Mayo评分和简化CD活动指数(CDAI)，所有病例病情均处于活动期。收集同期结肠癌术后肠组织标本30例(切缘大体和光学显微镜下均未见癌组织的正常结肠、回肠组织)，以及健康体检者和健康志愿者外周血标本35例作为对照组。研究方案经医院伦理委员会审核批准，研究对象对标本采集均知情同意。

二、主要试剂

兔抗人MMP-7多克隆抗体、兔抗人SDC-1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔二抗、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；人SDC-1 ELISA试剂盒(武汉优尔生商贸有限公司)。

三、方法

1. 免疫组化法检测肠组织MMP-7、SDC-1表达：肠组织标本4%甲醛固定，常规石蜡包埋，2 μm厚连续切片。切片常规脱蜡、水化，枸橼酸盐缓冲液抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清室温封闭30 min，加入MMP-7抗体(工作浓度1∶600)或SDC-1抗体(工作浓度1∶800)，4 ℃孵育过夜，反应增强液室温孵育20 min，加入HRP标记的二抗室温孵育20 min，DAB显色，1%盐酸乙醇分化，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

结果判定：光学显微镜下见胞质/胞膜染色为阳性细胞。在双盲条件下，由2名医师在200倍视野下随机选取5个清晰无折叠的视野，计数阳性细胞数，取均值，并观察染色强度。阳性细胞率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色强度：无染色，0分；浅黄色，1分；黄色，2分；棕黄色，3分。免疫组化评分为两项评分的乘积：0分，阴性(-)；1～4分，弱阳性(+)；5～8分，阳性(++)；9～12分，强阳性(+++)。

2. ELISA法检测血清SDC-1含量：外周血标本离心分离血清，-80 ℃保存。设置标准孔、空白孔和待测样品孔，分别加样，37 ℃温育1 h，加入生物素化SDC-1抗体，37 ℃温育1 h，洗涤，加入HRP标记的链霉亲和素，37 ℃温育30 min，洗涤，显色后终止反应。于酶标仪450 nm波长处读取各孔吸光度值(A值)，根据标准曲线得出样品浓度。

四、统计学分析

结 果

一、一般情况

45例IBD肠组织标本中，UC 27例，CD 18例；50例IBD外周血标本中，UC 28例，CD 22例。病例组性别构成和年龄与相应对照组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 采集肠组织和外周血标本IBD患者的一般情况

二、肠组织MMP-7表达

免疫组化染色显示，对照组肠组织中可见极少量MMP-7阳性细胞，染色强度较弱；UC组和CD组肠组织中可见大量胞质黄色或棕黄色染色的MMP-7阳性细胞，主要为肠上皮细胞，特别是溃疡边缘的肠上皮细胞，同时黏膜下层浸润的炎性细胞中亦有MMP-7表达(图1)。UC组和CD组MMP-7免疫组化评分均明显高于对照组，差异有统计学意义(8.17±1.17、8.67±1.97对0.33±0.52,P<0.05)，UC组与CD组间差异则无统计学意义(P>0.05)。

Spearman相关系数分析显示，在IBD患者中，肠组织MMP-7表达与UC和CD疾病活动度均呈显著正相关(UC:rs=0.519,P<0.05; CD:rs=0.583,P<0.05)。

三、肠组织SDC-1表达

免疫组化染色显示，对照组肠组织中可见较多黄色或棕黄色染色的SDC-1阳性细胞，染色强度较强，多分布于肠上皮细胞的基底外侧膜；UC组和CD组肠组织中SDC-1阳性细胞较少，染色强度较弱，呈浅黄色(图1)。UC组和CD组SDC-1免疫组化评分均明显低于对照组，差异有统计学意义(2.17±0.98、1.83±0.41对6.50±1.76,P<0.05)，UC组与CD组间差异则无统计学意义(P>0.05)。

Spearman相关系数分析显示，IBD患者肠组织中的MMP-7表达与SDC-1表达呈显著负相关(rs=-0.646,P<0.05)。

四、血清SDC-1含量

IBD肠组织中MMP-7的剪切作用使SDC-1胞外域脱落增加，可致外周血游离SDC-1含量增高。本研究进一步以ELISA法检测各组血清SDC-1含量，结果显示UC组和CD组血清SDC-1含量均明显高于对照组，差异有统计学意义[(34.24±10.24) ng/mL、(35.78±19.51) ng/mL对(19.44±3.69) ng/mL,P<0.05]，CD组略高于UC组，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。

Spearman相关系数分析显示，IBD患者肠组织中的SDC-1表达与血清SDC-1含量呈显著负相关(rs=-0.667,P<0.05)。

讨 论

IBD是一组以腹痛、腹泻、黏液脓血便为临床特征的慢性肠道炎症性疾病，病因和发病机制不明，病情反复发作，近年来其发病率在我国乃至全球均呈上升趋势[6]。MMP-7为MMPs家族中的一员，可表达于多种器官受损的黏膜上皮细胞中，如胃肠道、肺、肾脏、角膜等[7-10]，参与损伤组织的上皮修复和再生以及肿瘤的发生、发展，但其在IBD中的作用尚未完全明确。有研究[11]发现，在UC肠组织中，MMP-7主要表达于溃疡边缘上皮细胞，且其表达与炎症程度相关。另一项研究[12]显示，MMP-7在UC腺上皮中的表达与糜烂发生呈正相关；在CD肠组织中，MMP-7在炎性浸润部位呈强阳性表达。Puthenedam等[13]的研究发现，MMP-7可剪切半乳糖凝集素-3，使其活性降低，进而影响IBD肠道损伤的修复。另有研究[14]表明，野生型急性结肠损伤小鼠的死亡率显著高于MMP-7-/-结肠损伤小鼠，前者肠道损伤的修复(包括上皮细胞增殖、隐窝结构重建)虽快于后者，但中性粒细胞浸润深度和范围亦更大，导致损伤加重。上述结果提示了MMP-7在肠道损伤修复过程中的双重作用，组织受损时其表达增加，一定量的MMP-7为损伤修复所必需，表达过量则不利于损伤修复，甚至会加重肠道损伤。本实验发现IBD患者肠组织中的MMP-7表达较正常肠组织显著增强，并与疾病活动度呈显著正相关，与既往研究结果一致，提示在IBD中，MMP-7过表达不利于肠黏膜上皮修复，甚至可能诱发溃疡。MMP-7是IBD潜在的治疗靶点，应用其抑制剂或可减缓IBD疾病进程。

SDC-1又称CD138，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员之一，生理情况下表达于多种细胞的细胞膜，主要由保守的胞质结构域、跨膜结构域和含硫酸乙酰肝素糖胺聚糖链的胞外结构域组成。SDC-1在促进组织修复、调节免疫功能等方面发挥重要作用，同时还可调节紧密连接的组成并维持黏膜屏障功能[3-4]。Floer等[15]的研究发现，SDC-1对小鼠实验性结肠炎具有保护作用。IBD时大量分泌的促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)可下调肠上皮细胞表面的SDC-1表达，其表达下调归因于蛋白胞外域的脱落，因此IBD患者外周血可溶性SDC-1含量显著增加[16-17]。SDC-1是MMP-7的作用底物之一[18]，IBD患者肠组织中过表达的MMP-7剪切SDC-1，使其胞外域脱落并失去活性，进而使SDC-1促进受损肠组织修复的功能降低。本研究发现IBD患者肠组织中SDC-1表达减弱，并与MMP-7表达呈显著负相关，为理解IBD患者肠组织损伤修复延缓、MMP-7表达增强、SDC-1功能下降的现象提供了依据。本研究同时发现IBD患者血清SDC-1含量明显增高，与肠组织中MMP-7剪切SDC-1增加相一致，提示IBD患者的血清游离SDC-1可在一定程度上反映其在肠组织中的丢失情况。

图1 MMP-7、SDC-1在IBD患者肠组织中的表达(免疫组化染色，×200)

综上所述，本研究主要发现活动期IBD患者肠组织中MMP-7表达增高，并与疾病活动度呈正相关，提示其可能参与了IBD的发生、发展，在疾病活动度评估以及作为IBD的治疗靶点方面具有潜在应用价值。肠组织中的MMP-7通过剪切SDC-1影响受损肠组织修复，进而引起血清游离SDC-1含量增加，后者可能作为区分IBD与非IBD以及评价IBD药物疗效的生物学标记物。本实验为单中心观察性研究，研究样本量较小，未来拟开展多中心研究以及更深入的基础研究，进一步阐明MMP-7在IBD中的作用机制。