HIF-1α基因多态性与VCI及MRI表现的相关研究

陈捷 王志敏 陶晓晓 黄丹江 解晶

血管性认知障碍（VCI）是一组包括由于血管因素导致的各种认知障碍类型，其中包括无痴呆型血管性认知障碍（VCI-ND）、血管性痴呆（VD）。研究认为，腔隙性脑梗死（LI）可能是血管性痴呆的主要脑血管疾病类型之一。低氧诱导因子（HIF）在哺乳动物体内是一种非常重要的氧调节因子，可以调节许多低氧相关基因的表达。与脑梗死后发挥缺氧缺血后的神经保护作用密切相关。本研究在基因水平上观察血管性认知功能障碍患者MRI参数变化及影响，探讨HIF-1α基因多态性与LI患者血管性认知功能障碍的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月至2017年5月本院收治的VCI患者68例。及同期正常体检者50例。VCI-ND组43例，受教育程度：＜中学15例，≥中学28例。VD组25例：受教育程度：＜中学13例，≥中学12例。所有患者均符合美国国立神经病学与卒中研究所（NINDS）诊断标准及认知功能障碍标准［1-2］。排除标准：（1）合并其他各个系统严重疾病，严重心脏疾病，严重各系统性感染，严重肝、肾功能不全，自身免疫学疾病，肿瘤等。（2）拒绝签署知情同意书者。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属知情并签署知情同意书。

1.2 方法 记录所有患者一般资料（性别、年龄等）、家族情况。入院后统一由神经内科医师采计算CMC评分；同时记录其他心脑血管相关危险因素，如吸烟史和高血压、糖尿病、高尿酸血症、同型半胱氨酸血症等病史。所有患者均行MRI检查及HIF-1α基因多态性检测。

1.3 MRI检查 应用西门子Avanto的1.5T超导型磁共振成像扫描系统，梯度场强度40mT/m，梯度切换率150mT/m/ms，对所有受试者进行头部MR/平扫，包括Tl加权像、T2加权像、弥散加权像和液体衰减翻转恢复序列（Flair像）。所有MRI数据由对该研究不知情的两位副主任医师以上影像学医师进行处理。如两位影像学医师对结果有异议，请第三位副主任医师以上影像学医师裁决。并进行皮质下白质疏松评分及腔隙性脑梗死评分。

1.4 基因检测 于入院次日清晨空腹留取5ml静脉血提取DNA。HIF-1α基因SNP的选择基因多态性的检测，选取代表性的SNPs位点共4个（rs3783752，rs4899056，rs1957757，rs10873142）。 使 用 primer 5.0设计引物（见表1），采用直接测序方法，读取个体的基因型，所有基因检测由华大基因公司完成。

表1 HIF基因SNPs位点分型所用引物及测序引物

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。危险因素统计、认知功能量表测定及MRI参数比较均分层比较，基因比较首先分正常组及VCI组比较，后将VCI组分层比较。基因型行哈迪温伯格平衡检验，计算基因型频率；卡方检验两组间等位基因型频率分布差异。block根据 D'＞0.9以及 r2＞0.8进行定义。频率 ＜3% 单倍型被排除不再进行统计学检验。计算各SNP间连锁不平衡程度。估算各单倍型频率，比较正常组和VCI组间等位基因频率和单倍型频率的差异。

2 结果

2.1 危险因素比较 见表2。

表2 各组受试者血管性危险因素的比较［n（%）］

2.2 认知功能评价及影像学比较 见表3。

表3 各组受试者认知功能评分及MRI 检查结果的比较［分，（x±s）］

2.3 正常组与VCI组HIF-1α基因多态性 见表4。

2.4 VCI组分层HIF-1α基因多态性 见表5。

2.5 连锁不平衡分析 正常组连锁不平衡分析发现单倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度连锁（D'＞0.9，r2＞0.8），VCI组发现单倍型（rs3783752-rs1957757）高度连锁，见图1、2。

表4 两组患者HIF-1α基因多位点基因型分布情况

表5 HIF-1α基因多位点基因型VCI组分层患者中的分布情况

图1 正常组Linkage Disequilibrium分析

图2 VCI组Linkage Disequilibrium分析

2.5 单倍体分析 见表6。

表6 HIF-1α基因多态性单倍体分析结果

2.6 VCI组HIF-1α基因多态性分层MRI评价 见表7。

表7 VCI组HIF-1α基因多态性分层MRI评价

3 讨论

LI的发生机制通常由于颅内深部的小穿通动脉管壁发生梗阻性病变所致，约占所有缺血性脑血管病的25%［3］。LI由于临床症状的低显性易被忽视。结果显示，LI不仅是缺血性脑血管病复发的风险因素，同时也可能是导致血管性认知功能障碍的重要危险因素之一。Edwards等一项大样本临床随机对照研究（1636例）发现［4］，约47%的LI患者存在轻度认知功能损害。Makin［5］等Meta分析纳入约7575名脑血管病患者，结果显示2860名LI患者中约24%存在现认知功能损害现象。

本资料对所有患者进行危险因素筛查，发现各组受试者年龄。性别。糖尿病病史比较，差异无统计学意义，而吸烟史、高血压病史以及短暂性脑缺血发作和卒中史比较，差异有统计学意义，与既往研究相类似。而认知功能评估及影像学比较，各组受试者MMSE 评分。CCSE 评分和CMC评分比较及MRI 检查测得的皮质下白质疏松和腔隙性脑梗死的评分比较均有显著意义。VD人群的白质疏松和腔隙性脑梗死评分均显著高于VCI-ND人群及正常人群，研究结果与国内外研究结果类似。MRI可以显示脑白质病变及特异性脑结构评估表现正常的脑白质区的功能。国外研究［6-7］显示：脑白质的完整性与认知功能存在正相关性，脑白质的损伤与MCI的发生也存在强相关性。

本资料对HI F-1α基因多态性四个位点进行检测，将人群分类按照是否存在认知功能障碍分成两组，发现两组rs4899056位点及rs10873142位点存在阳性意义，其中，rs4899056基因位点VCI组TT基因型分布频率较正常组低，rs10873142基因位点VCI组CC基因型分布频率较正常组低。而将认知功能障碍人群进行分层分析，结果未见异常。同时基因连锁不平衡分析发现，正常人群中发现单倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度连锁，异常组仅为发现单倍型（rs3783752-rs1957757）高度连锁，基因单倍体分析，单倍型块（rs3783752- rs4899056-rs1957757-rs10873142）ATTC，GCCC，GCCT单倍体基因型两组有显著差异，其中ATTC，GCCC均为保护因素，GCCT为危险因素。但在各位点分层分析与MRI白质疏松和腔隙性脑梗死评分，均未见异常。

脑梗死与缺血缺氧机制密切相关，目前研究较多的HIF，是一种非常重要的氧调节因子，可以调节许多低氧相关基因的表达［6］。HIF由α和β两个亚基构成，其中α亚基为调节亚基。HIF-1α亚基编码基因位于人类染色体14q21-24，含15个外显子和14个内含子。在HIF-1α基因内SNP位点有诸如一下几个位点：rs3783752、C111A、rs61755705、rs4899056、rsl957757、rsl0873142、rs41508050、rsll549465、rsll549467、rsl802821。在21%O2和7%O2环境中检测活体中HIF-1αmRNA表达水平，发现在缺氧条件下细胞内HIF-1α mRNA分布广泛并高表达。在缺氧条件下，α亚基能与β亚基结合，形成一个二聚体。HIF的形成与低氧应答基因中的低氧应答元件有关。介导缺氧基因的转录表达，维持氧平衡的平衡。在缺血缺氧过程中，HIF-1α的羟化受到干扰，通过调整促凋亡蛋白Caspase 3靶基因表达。改善细胞能量代谢抑制凋亡。在氧糖剥夺（OGD）后，磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路可被激活。随着缺血缺氧时间和程度的不同，细胞内HIF-1α也可通过诱导p53、Noxa、HGTDP，调节相关细胞毒作用调控细胞凋亡程度［7］。