淹水条件下外源含硫有机物对稻田土壤铜形态转化的影响

孙丽娟 ，秦秦，宋科，孙雅菲，薛永*，施积炎*

1. 上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403；2. 浙江大学环境污染防治研究所，浙江 杭州 310058

铜（Copper，Cu）虽然是生物必需的营养元素，但吸收或摄入过量的铜又会对植物或动物产生毒性效应，铜的生物有效态是指土壤中可能被生物吸收的铜的形态，进入到土壤中的铜经过沉淀/溶解、吸附/解吸、氧化/还原、络合/离解等一系列化学反应形成不同固相和液相形态，其浓度及形态对植物和微生物的环境产生不同程度毒性，而环境条件如pH、氧化还原电势（Eh）、水硬度（碳酸盐含量）、有机物、铁锰氧化物等均会以直接或间接的方式影响土壤铜的形态转化，从而影响铜的生物有效性（Flemming et al.，1989）。

植物根系在生长发育过程中可以向外界环境分泌渗出物、分泌物、粘胶质以及裂解物质4种类型根系分泌物（root exudates），根系向环境释放的有机碳量可占植物固定总有机碳量的 1%－40%（Bais et al.，2006）。水稻根系分泌物主要包括一些小分子有机酸、氨基酸、糖、生长物质等有机化合物，部分有机化合物对植物吸收重金属过程有较大影响，可通过改变根际环境的 pH、Eh、微生物群落结构及丰度等从而影响根系对金属的吸收（常学秀等，2000）。

含硫有机化合物（主要包括甲硫氨酸和半胱氨酸等）虽然是根系分泌物中较少量的一部分，但是由于土壤重金属具有优先与含硫官能团结合的趋势（Hesterberg et al.，2001），例如Hg2+与土壤胡敏酸中巯基官能团结合后形成的共价化合物的 logK值达 34.5－38.3（Hesterberg et al.，2001），即使是微克每升级含量的甲基汞亦可与土壤有机质中的还原态有机硫化合物结合（Karlsson et al.，2003），其 logK 值为 12.15－14.48（Hintelmann et al.，1997），可见，土壤有机硫对重金属环境行为具有显著影响。研究含硫有机分泌物对土壤铜迁移转化的影响可深入了解土壤铜的生物地球化学循环过程。前期研究证明水稻根际土壤铜的形态转化与半胱氨酸有关，根际土壤部分铜以半胱氨酸形态存在（Sunet al.，2015；Sunet al.，2019），因此，本研究重点以半胱氨酸和甲硫氨酸两种典型的含硫有机化合物为硫源，探讨外源添加有机硫对淹水状态下土壤铜形态转化及生物有效性的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与试验设计

供试土壤（0－20 cm）采自浙江省富阳市环山乡某冶炼厂（119°55′29.7′′E，29°56′22.6′′N）周边抛荒水稻田。土壤样品经自然风干、研磨、过筛（2 mm）后备用。土壤基本理化性状如表1所示。

L型半胱氨酸（L-Cysteine）、甲硫氨酸（L-Methionine）均购自 aladdin-阿拉丁试剂有限公司，供试土壤经高压灭菌处理后，称取500 g置于500 mL烧杯中，半胱氨酸和甲硫氨酸的添加浓度分别为0、50、100 mg·kg-1，充分拌匀后，加入去离子水，保持4－5 cm的淹水条件，定期补充蒸发的水分。将烧杯静置于小型人工气候室（浙江求是人工环境有限公司）中，控制条件为：湿度60%－70%，温度25－28 ℃，光照时间16 h·d-1，光照强度150µmol·m-2·s-1。分别于淹水 7 d、14 d、21 d 及 28 d在淹水表层采集少量土壤样品，冷冻干燥后置于真空干燥器中，待用。每个处理设置3次重复，共15个样本量。

1.2 样品分析

1.2.1 土壤基本理化性质

土壤 pH、有机质、阳离子交换量等测试方法参照鲁如坤（2000）编写的《土壤农业化学分析方法》中推荐的方法，重金属及硫元素含量使用ICP-OES 测定（iCAP 6300，Thermo，USA）。

1.2.2 土壤pH测定

采集样品前，利用Orion 5 Star台式pH玻璃电极（Thermo Orion，Thermo Fisher Scientific，USA）原位测定表层土壤pH值。

1.2.3 土壤有效态铜含量测定

采用一步提取法提取土壤有效态铜，分别用0.01 mol·L-1CaCl2和 DTPA 混合液（包括 0.005 mol·L-1DTPA、0.01 mol·L-1CaCl2、0.1 mol·L-1TEA混合液）提取（Quevauviller，1998），具体过程见表2。

CaCl2提取态：称取 2.0 g冷冻干燥（Alphal-4LSC，德国）后的土壤置于50 mL离心管中，加10 mL 0.01 mol·L-1CaCl2溶液，涡旋振荡仪振荡 15 s后于 20 ℃、200 r·min-1下振荡 2 h；12000 g、20 ℃下离心10 min，过滤，待测。

DTPA提取态：称取4.0 g冷冻干燥后的土壤置于50 mL离心管，加10 mL DTPA混合液，在涡旋振荡仪上振荡15 s 后，于20 ℃、200 r·min-1下振荡2 h；12000 g离心10 min，过滤。

1.2.4 土壤铜形态分析

铜的K边X射线近边吸收谱学（XANES）在北京同步辐射装置（BSRF）的1W1B线站采集，辐射装置储存环能量为2.2 GeV，束流强度为140 mA，土壤样品经压片机压片（直径10 mm，厚2 mm）后，利用 3M胶带（Scotch，USA）将其固定在金属样品架上待测。采用Lytle探测器在荧光模式下采集铜的K边吸收谱线。数据谱线采集后利用IFFEFFIT数据包中的Athena软件对数据进行预处理及归一化处理。采用Cu片（Cu foil）作为内参比，利用Athena软件将其谱线的一阶导数的极大值能量（E0）校准至理论值8979 eV，其余实验谱线及标准样品均参照 Cu片的能量偏移量进行校准。参与拟合标准物的选择通过 Sixpack软件进行主成分分析，确定主成分个数后，逐个对标准样品进行目标转换，依据目标转换spoil值的大小确定参与拟合的标准物（Manceauet al.，2002）。参照spoil值及主成分个数，在Athena软件中进行线性拟合，将拟合结果导入Origin 8.0进行图形化处理。

1.3 数据分析

运用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），图表中数据为平均值±标准差。处理组显著性分析采用最小显著差异法（LSD）进行检验（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical characters of the tested soil

表2 土壤重金属生物有效态的一歩提取法Table 2 The bioavailable fraction of heavy metals in soil extracted by single extraction

2 结果与分析

2.1 淹水时间和硫添加对土壤pH影响

不同淹水时间下的土壤pH变化如图1所示，整体而言，不同处理组中土壤pH值随着淹水时间的延长呈现先下降再上升的变化趋势，与对照组相比，各个处理组对土壤pH变化影响并不显著，这可能与本实验中有机物的施加浓度较低有关。

图1 不同淹水时间下土壤pH的变化Fig. 1 pH value of soil under different flooding time

2.2 淹水时间和硫添加对土壤铜生物有效性的影响

2.2.1 土壤可交换态铜变化

图2 不同淹水时间下土壤CaCl2提取态铜质量分数的变化Fig. 2 Mass fraction of CaCl2 extractable Cu in soil under different flooding time

土壤CaCl2提取态铜质量分数一般用于表征土壤可交换态铜含量（Xu et al.，2015），如图2所示，随着淹水时间的延长，土壤可交换态铜质量分数在3－7 mg·kg-1范围内，整体呈逐渐降低趋势，淹水前期（21 d前），可交换态铜含量降低缓慢，而从淹水21－28 d时，可交换态铜含量急剧下降。淹水前期，不同种类的有机物及不同浓度对土壤可交换态铜的影响并不显著，淹水21 d时，有机硫化物的各个处理组的可交换态铜含量均高于对照组，而到淹水28 d时，各处理组的可交换态铜含量均降低至3 mg·kg-1左右，且各处理组无显著性差异。

2.2.2 土壤有机结合态铜变化

土壤DTPA提取态铜质量分数可用于表征土壤有机结合态铜含量（Xu et al.，2015），由图3所示，土壤有机结合态铜在 150－225 mg·kg-1范围内波动，整体呈现先升高后降低的趋势。淹水前期，有机物施加对土壤有机结合态铜含量的影响不显著，而到淹水21 d，两种含硫有机物施加处理组中的有机结合态铜均低于对照组，甲硫氨酸表现显著（P＜0.05），淹水28 d，含硫有机物处理组中土壤有机结合态铜含量高于对照处理组。

图3 不同淹水时间下土壤DTPA提取态铜质量分数的变化Fig. 3 Mass fraction of DTPA extractable Cu in soil under different flooding time

2.3 淹水时间和硫添加下土壤铜的XANES分析

采集淹水21 d的土壤，冷冻干燥后在北京同步辐射装置的 1W1B线站采集对照组及 100 mg·kg-1含硫有机物（半胱氨酸及甲硫氨酸）处理组土壤样品中铜的K边XANES，得到的谱线如图4所示，土壤样品中铜的XANES谱的主要吸收峰位于8995 eV处，另外在8981 eV处有1个较小的吸收白线锋，这两个峰分别为二价铜和一价铜的吸收峰。土壤铜的K边XANES谱线线性拟合结果如表3所示，铜的主要形态由硫化亚铜（Cu2S）、缬氨酸铜（Cu-valine）及针铁矿结合态铜（Cu-goethite）组成，其中Cu-valine占比较大（53.8%－69.7%），其次为Cu2S和Cu-goethite，可以看出，施加含硫有机化合物可增加土壤中Cu-valine的占比，与对照组相比，半胱氨酸和甲硫氨酸处理组中 Cu-valine占比的增幅分别为15.9%和8.5%，与此同时，Cu-goethite占比分别降低19.3%和11.4%，Cu2S的占比变化不大。可见，淹水条件下含硫有机化合物的添加可促进土壤中缬氨酸铜类化合物比例的增加。

图4 淹水3周土壤及标准样品铜的XANES谱线Fig. 4 Comparison of Cu K-edge XANES spectra of reference compounds and soil samples treated with sulfur compounds after three weeks of flooding

表3 不同处理组中土壤铜的K边XANES谱线线性拟合结果Table 3 Linear combination fitting results of the Cu K-edge XANES spectra of soil samples treated with 100 mg·kg-1 sulfur compounds

3 讨论

3.1 淹水条件下含硫有机物对土壤pH的影响

根系有机分泌物是根际微域影响重金属环境行为的重要因素之一，根泌物可通过改变根际微生物活性、根际理化性质、根生长过程等间接影响重金属的行为，也可直接通过酸化、螯合、沉淀或氧化还原等反应影响重金属的形态转化。不同作物根系分泌物组成具有较大差异，主要分为氨基酸、有机酸、酚类、多糖和胡敏酸等化合物（Baiset al.，2006），柠檬酸、草酸及苹果酸被认为是根际微域影响较大的有机酸（Joneset al.，2003），研究表明水稻根分泌物中大量氨基酸主要有组氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸，少量氨基酸有天冬氨酸、精氨酸、络氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等（Bacilio-Jiménezet al.，2003）。本研究中添加含硫有机物的土壤随着淹水时间的延长，土壤pH出现先下降再上升的趋势，短期淹水状态下，土壤中微生物呼吸释放的 CO2溶解形成 H2CO3，H2CO3水解为 H+和 HCO3-，使得土壤溶液 pH降低（Ponnamperuma，1972）。Khaokaew et al.（2011）研究也发现稻田土壤在短期淹水后，pH出现下降，约30 d后趋于稳定状态，本研究中土壤溶液pH在21 d后呈升高趋势，这与供试土壤为弱酸性土壤有关，在酸性土壤中淹水至一定还原条件后，Fe3+可被还原为 Fe2+[Fe(OH)3+3H++e-=Fe2++3H2O]，该过程消耗 H+，从而引起土壤溶液pH的增大。外源含硫有机物的添加对土壤pH变化影响不显著，可能与本实验体系中含硫有机物施加量较小有关。

3.2 淹水条件下含硫有机物对土壤铜形态转化的影响

土壤重金属的化学行为与土壤固相粘土胶体、氧化物及有机质等密切相关，此外土壤溶液的pH、竞争离子等也会影响重金属在土壤固相中的吸附（Temminghoff et al.，1997）。在酸性土壤中，有机质是影响重金属如铜、镉形态的重要因素之一，例如溶解性有机质与铜通过化学键结合形成的Cu-DOC化合物可促进铜在土壤中的移动性和生物有效性（Temminghoffet al.，1994；Benedettiet al.，1995）。Weng et al.（2002）研究发现，相比其他重金属（如Cd、Zn和Ni），Cu和Pb与溶解性有机质结合更显著，Nguyen et al.（2017）研究也发现根际土壤中有效态的Ni和Cu浓度与溶解性有机质浓度呈正相关关系。本研究中所用到的含硫有机酸均为溶解性有机质，可溶于水，因而在淹水21 d，有机酸添加组里土壤的可交换态铜含量均显著高于对照组。

DTPA提取态重金属用于表征重金属的生物有效性，而有机质的添加有利于提高土壤重金属的生物有效性，Leita et al.（1999）研究发现土壤DTPA提取态重金属含量随着土壤有机碳施加量的增加而升高，可能是因为土壤有机质矿化的过程中，金属可被有机物释放出来致使其移动性和有效性增大。此外，有机质含量较高的条件下，自然存在的细菌等微生物代谢活动加剧，产生较多的水溶性有机化合物的增加可促进溶解态重金属的增大。土壤水稻秸秆生物质炭的添加可促进有机结合态 Cu、Cd和Pb浓度增大（Luet al.，2017）。本研究中，淹水28 d后，有机酸添加处理组中的土壤DTPA提取态铜显著高于对照组，而前期并没有出现显著性差异，表明有机酸的添加需要一定的时间平衡稳定后，才会对土壤铜的生物有效性起到作用。

甲硫氨酸和半胱氨酸的等电点（pl）分别为5.74、5.2。土壤溶液中的 pH＞6，高于这两个等电点，因为甲硫氨酸和半胱氨酸均可结合水中的OH-而带负电，H+继续在水溶液中而使得土壤溶液 pH降低，两者因等电点相差不大导致土壤溶液pH无显著差异。由于pH的降低导致施硫处理组中土壤CaCl2提取态Cu和DTPA提取态Cu含量均高于对照组，说明含硫有机分泌物的释放会提高土壤 Cu的生物有效性。Cu的K边XANES研究表明，有机硫施加促进土壤中缬氨酸铜（Cu-valine）含量的增加，而针铁矿吸附态铜（Cu-goethite）含量减少，可能原因是由于淹水时间较短，施入土壤中的甲硫氨酸和半胱氨酸带负电，甲硫氨酸的羧基及半胱氨酸的巯基被 OH-包被，能与 Cu起作用的主要是-NH2部分，从而使得 Cu与类似于缬氨酸的-NH2结合量增多。土壤中与-NH2结合的Cu能被DTPA络合剂提取，因而淹水28 d后含硫有机化合物增大了DTPA提取态Cu浓度。

4 结论

（1）供试土壤中，随着淹水时间的延长，土壤pH先降低后升高，而本实验中小分子含硫有机酸的施加对土壤体系的pH的影响不显著。

（2）淹水21 d后，小分子有机酸的增加可促进土壤可交换态铜含量的增大，而有机结合态铜含量降低，淹水28 d时，含硫有机酸添加对土壤可交换态铜含量影响不显著，有机结合态铜含量显著升高。

（3）淹水21 d后，土壤铜主要化学形态由缬氨酸铜、针铁矿铜及硫化亚铜组成，而含硫有机物的施加可促进淹水 21 d土壤缬氨酸铜类化合物占比的增大，针铁矿结合态铜的降低，铜主要与缬氨酸的-NH2结合。