东江下游典型饮用水源地抗生素抗性基因分布研究

房平，代鹤峰, ，庄僖，谢宏琴，罗伟铿，任明忠，郑晶*

1. 西安工程大学城市规划与市政工程学院，陕西 西安 710600；2. 国家环境保护环境污染健康风险评价重点实验室，广东 广州 510535；3. 东莞市环境监测中心站，广东 东莞 523000

自1929年英国科学家Flming发现青霉素以来，抗生素得到迅速发展，种类不断丰富（苏怀德，1988），被广泛用于人类医疗、家禽养殖、畜牧业和水产养殖（曾冠军等，2017；程宪伟等，2017），但这些用于医疗、养殖的抗生素并不能被全部被吸收，80%以上的抗生素以其原始形态被输送至环境中（Sarmah et al.，2006）。随着抗生素的滥用，细菌对环境中的抗生素产生了抗性（Inyinbor et al.，2018），抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）作为一种新型的环境污染物由Pruden et al.（2006）明确提出。中国作为抗生素的使用大国，滥用抗生素严重影响环境中ARGs的丰度水平，因此对中国环境中ARGs污染进行检测研究非常有必要性（罗义等，2008）。

随着国内对 ARGs污染的重视，针对 ARGs的研究发现 ARGs在土壤、空气和水体中均有分布（张俊等，2014；张兰河等，2016；高敏等，2017；高盼盼等，2009）。水环境中ARGs污染水平受多种因素的影响，例如，邹世春等（2009）对北江河水中ARGs进行研究，发现sul1与sul2两种基因的污染水平与该水域中磺胺类抗生素的含量分布有关，说明外源性抗生素对河流的污染是诱导 ARGs的重要因素；赵晓祥等（2018）发现上海地区水体中的 ARGs与微生物、温度、悬浮物等影响因素相关。

饮用水源地水质问题关系到居民的健康安全，因此饮用水源中 ARGs的污染水平也日益得到关注，虽然目前对水环境中ARGs的研究很多，但是针对饮用水源地中ARGs的研究却相对较少。本文主要研究东江下游典型的河流型饮用水源地和湖泊型水源地水体中ARGs的分布，对3类8种ARGs进行检测，探究水源地类型与ARGs的关系，及部分影响因素和ARGs之间的相关性，为饮用水源地的抗性基因污染状况及生态风险管理提供基础数据和依据。

1 材料与方法

1.1 实验器材

StepOnePlus™ Real-Time PCR（Polymras Chain Raction）仪（美国ABI公司），Sorvall ST16R通用冷冻离心机（美国Thermo公司），Mupid-exu电泳仪（日本TAKARA公司），孔径0.45 μm直径47 mm玻璃纤维滤纸，ABI Veriti96 PCR仪（美国ABI公司），DNeasy PowrWater水样微生物DNA提取试剂盒（德国QIAGEN GmbH公司）。

1.2 采样位点

于2018年3月选取东江下游地区河流型饮用水源保护区9个（其中6个采样点布设在供水厂取水口）和湖泊型水源地5个监测点进行采样（如图1），其中YY-1－YY-3为东江下游干流水源地采样点，GS-1－GS-6为供水厂取水口，SK-1－SK-5为湖泊型水源地（全部为备用水源地）采样点。

1.3 水样采集

每个点位采集水样2 L，水样采集深度在水面以下0.5－1.0 m之间，水样采集完毕后现场使用美国HQd便携式水质分析仪检测pH、溶解氧（DO）两个指标，指标检测完毕之后迅速将水样置于冷藏箱中于12 h内运送至实验室并储存于4 ℃环境下。

1.4 DNA提取

所采水样用0.45 μm玻璃纤维滤膜通过规格1 L的溶剂过滤器过滤，过滤后的滤膜置于4 ℃下冷藏，用于DNA的提取。使用DNeasy PowrWater水样微生物 DNA提取试剂盒提取滤膜上的 DNA，DNA提取按照德国QIAGEN GmbH公司所提供方法进行操作。

1.5 ARGs的普通PCR扩增

本研究的目的基因包含磺胺类 ARpHGs 3种（sul1、sul2、sul3），四环素类 ARGs 4种[tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(G)]，大环内酯类 ARGs 1种（ermB）。对所提取的水样中的DNA进行检测，目的ARGs引物详细信息见表1。普通PCR扩增实验采用25 μL反应体系。

普通 PCR 25 μL 反应体系：Premix Taq（Ex Taq version 2.0 plus dye）（日本 TAKARA）12.5 μL；上下游引物各 1 μL；模板 DNA 1 μL；ddH2O 9.5 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性15 s；退火（各引物的退火温度见表1）30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。得到的产物置于4 ℃低温冷藏保存，用3%的琼脂糖凝胶电泳检测产物。

1.6 实时荧光定量PCR

实时荧光定量 PCR使用 ABI StepOnePlus™Real-Time PCR仪器进行测定。根据实验结果得到标准曲线，并对待测样品进行丰度检测。

Realtime PCR反应体系：SYBR®Fast qPCRmix 12.5 µL，上下游引物 10 µmoL·L-1各 0.5 µL，DNA模板1 µL添加ddH2O至体积为25 µL。

图1 东江下游典型饮用水源地采样点位分布图Fig. 1 Sampling point distribution map of typical drinking water sources in the lower Dongjiang River

表1 ARGs引物及退火温度Table 1 Primers of ARGs and annealing temperature

反应程序：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，退火（各引物的退火温度）30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。

标准曲线实验所用到的标准质粒的引物序列及片段长度如表2所示。标准质粒交由生工生物工程（上海）有限公司进行合成。质粒合成后，将质粒按照10∶1的比例稀释成7个梯度的DNA标准溶液，浓度为 103－109copies·L-1。

实验得到的8种ARGs的线性方程相关系数均≥0.99，其相关系数与扩增效率如表2所示。

2 结果与讨论

2.1 ARGs的检出率与丰度水平

表 3所示为各点位 ARGs的绝对丰度（单位copies·L-1）与 pH、DO 值。如表所示，磺胺类的sul1、sul2，检出率达到 100%，sul3的检出率也达到85.7%，这表明东江下游水源地普遍受到磺胺类抗生素的污染。四环素类的tet(G)检出率为100%，其次tet(O)、tet(M)检出率为92.9%，tet(Q)的检出率略低为 64.3%，大环内酯类ermB的检出率最低，仅为50%。ARGs检出率反映了水体受抗生素污染的种类有所不同，磺胺类和四环素类ARGs的高检出率与文献报道东江抗生素污染种类相吻合（赵腾辉等，2016）。

从表3可知，sul1的丰度水平最高，其绝对丰度范围为 2.37×107－4.79×108copies·L-1，sul2、tet(O)、tet(G) 3种ARGs的丰度水平相对较高，处于 103－105copies·L-1，tet(M)与ermB的丰度水平相对较低，在103－104copies·L-1之内，sul3的丰度水平最低，仅达到 102－103copies·L-1级别，远低于sul1与sul2的丰度水平，这可能与sul3的检出率较低有关（Hoa et al.，2008）。

表2 ARGs标准曲线Table 2 ARGs standard curve

东江下游典型饮用水源地ARGs污染水平较以往研究报道的水环境中ARGs研究结果低。张瑞全等（2013）报道东江流域西枝江sul1基因丰度水平为 9.78×106－9.94×108copies·L-1，sul2 基因的丰度水平在 1.49×105－2.77×108copies·L-1之间，sul3 基因丰度水平在 7.52×104－1.66×106copies·L-1，总体上高于本研究检出的sul1、sul2、sul3基因丰度，西枝江位于本研究河流区域段上游，是东江一级支流，非饮用水源保护区，是上游工农业排水的受纳水体。Jiang et al.（2013）对上海黄浦江及饮用水中ARGs与抗生素的关系进行研究，其检测结果表明，黄浦江sul1基因丰度水平为 3.2×107－1.74×108copies·L-1，sul2 基因的丰度水平在 4.3×107－4.19×108copies·L-1之间，tet(M)基因丰度水平为2.3×103－5.07×103copies·L-1，tet(O)基因丰度水平为 1.43×103－5.05×103copies·L-1，除sul2 基因丰度水平比本研究低外，其他3种基因丰度水平与本研究中ARGs丰度水平相差不大；Jiang（2013）选择黄浦江上游5个点作为研究对象，其中4个为非饮用水源保护区，1个为水源保护区，通过对比发现其作为饮用水源保护区的S2采样点所有ARGs的丰度水平均低于非饮用水源保护区的丰度水平。天津海河流域（杨继平等，2017）、黄浦江流域（沈群辉等，2012）、华东地区水源地（胡亚茹等，2018）和新疆玛纳斯河流域（周婷等，2014）检出的抗性基因sul1、sul3、ermB、tet(O)、tet(M)等的丰度水平也均高于本研究。通过对比研究发现，东江下游典型饮用水源地ARGs污染水平相对较低，饮用水源地的严格的保护制度和措施有助于减少抗生素抗性基因的污染。

表3 各点位ARGs的绝对丰度（单位copies·L-1）与pH、DO值Table 3 Absolute abundance (unit copies·L-1) and pH, DO value of ARGs at different sites

表4所示为ARGs之间及抗性基因与水质指标（pH和DO）的相关性。从表中可以看出，抗性基因的丰度与pH值、溶解氧等因素都具有显著的相关性（P＜0.05），除sul2 与tet(O)、tet(M)与tet(Q)外，其他抗性基因之间也有显著的相关性（P＜0.05），说明同类整合子各部分之间存在较强的相关性，此结果与Su et al.（2018）对饮用水系统抗性基因的研究结果类似。本研究水样的pH值在7.11－8.68之间，为弱碱性水环境，sul3、tet(O)、tet(Q)与pH值呈正相关，其他5种基因与pH值呈负相关，说明含有sul3、tet(O)、tet(Q)基因的微生物适宜在弱碱环境下生存。溶解氧 DO的范围为4.74－10.19 mg·L-1，范围覆盖从高至低，对水环境中ARGs的影响并不明确，与赵晓祥等（2018）发现的水体溶解氧对 ARGs丰度影响不明确的结论相一致。

表4 ARGs的相关性分析Table 4 Correlation analysis of ARGs

2.2 ARGs空间分布特征

河流中抗生素基因污染水平主要受沿江污染源输入的影响，本研究河流型水源地的9个采样点位（YY-1－YY-3，GS-1－GS-6）沿着东江自上而下分布，将各点位每一类抗性基因丰度进行相加得到总丰度，并将总丰度按沿江采样点从上游至下游进行拟合得到图2，可以看出东江河流型水源地总抗性基因丰度水平大致是沿着河流方向呈逐渐增大的趋势，进一步分析表明水体中总抗性基因水平主要受到沿江城镇分布的影响（张丹丹等，2018）。如图2所示，YY-1与GS-1相比，总抗性基因水平明显降低，该流段ARGs累积速率为负数呈现下降趋势，结合该段流域地形和社会经济状况，该江段基本没有大型城镇和工业区分布，水体中的抗性基因受自然衰减作用而有所降低。从YY-1－GS-6，水体中总抗性基因丰度水平急剧上升，累积速率达到0.053，这可能主要是这段流经企石镇镇区；GS-6－GS-5－GS-3总ARGs丰度略有增加，保持平稳的较高水平，主要还是受该段高度城市化的影响。GS-3－YY-2和GS-3－GS-4至YY3，总ARGs丰度水平明显下降，GS-3之后东江干流分东江北干流和南干流，北干流的采样点为GS-4和YY-3，所处区域经济水平相对落后，人口分布少，因此水体中总 ARGs丰度水平持续下降；南干流采样点YY-2－GS-2，总抗性基因丰度水平又急剧上升，达到东江下游地区至上而下河流型水源地采样点中的最高水平，这主要是受江段流经东莞市主城区的影响。

图2 河流型水源地ARGs沿河流方向分布规律Fig. 2 Distribution of ARGs in fluvial water source area along river direction

2.3 河流型水源地与湖泊型水源地 ARGs丰度对比

为比较东江下游地区河流型水源地和湖泊型饮用水源地ARGs丰度差异，按不同类型的水源地样本的ARGs丰度分别进行了统计分析（见表5）。河流型水源地的sul1丰度均值为 1.31×108copies·L-1，最高值为 2.88×108copies·L-1，其他 7种抗性基因丰度水平均值为3.25×105copies·L-1，最高值为 8.17×105copies·L-1，最高值均出现在下游GS-2，GS-2处于东莞主城区下游，可能主要受到城市面源的影响，ARGs污染明显高于其他采样点位。湖泊型水源地sul1的平均水平 5.47×107copies·L-1，最高值为 4.79×108copies·L-1，其他 7种抗性基因丰度水平均值为3.73×105copies·L-1，最高值为 1.41×106copies·L-1，最高值均出现在备用水源 SK-5，经调研，SK-5检出高丰度 ARGs，原因是在作为备用水源之前，该水库的水环境功能是工农业综合用水，水库曾经进行过大面积水产养殖，水产养殖投加了大量的抗生素，即使这几年加强了保护，仍然导致抗生素抗性基浓度水平高，甚至高于GS-2，是所有采样点中污染程度最高的点位。总体上，东江下游地区河流型水源地的抗性基因污染高于湖泊型水源地，这是由于东江下游湖泊基本上处于东江支流的上游地区，受到城市面源和上游输入影响较小，同时近年来通过禁养等措施能够有效降低抗生素污染。

3 结论

（1）东江下游典型饮用水源地ARGs绝对丰度水平在 2.37×107－4.80×108copies·L-1之间，磺胺类和四环素类ARGs检出率高，ARGs污染水平较国内其他水体低。

（2）东江下游河流型饮用水源地中抗生素基因丰度水平总体上呈现上游点位低于下游点位，沿江城市面源是影响水源地ARGs丰度水平变化的重要因素之一。

（3）东江下游地区河流型饮用水源地ARGs污染水平总体上高于湖泊型饮用水源地，禁养措施的实施有效降低了湖泊型水源地ARGs丰度水平。

表5 各点位sul1与其他7种ARGs丰度水平分析Table 5 Analysis of abundance levels of sul1 and other 7 ARGs at different sites copies·L-1