一例猪圆环病毒感染的PCR诊断及病案分析

潘淑惠，王 璇，吴玙彤，文正常＊

（贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005）

猪圆环病毒(Porcine circovirus，简称PCV)感染发病最早发现于加拿大(1991)，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行。现已知PCV有2个血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2为致病性病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,简称PMWS)的主要病原。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病，亦与PCV2感染有重要关联。现已被世界各国公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的一种猪免疫障碍重要传染病。2018年7月，贵州地区某县一地方黑毛猪养殖场，发生了一起商品猪以重度局灶性皮炎、皮下浅表淋巴结肿大为典型临床病理特征的传染性疾病，采集病料经实验室PCR特异性鉴别诊断，结果为猪圆环病毒感染阳性。在贵州地区以PDNS为特征的临床案例较为少见，现将相关诊断及发生情况给与报道，供广大同业者参考，希望对猪场的疫病防控有所帮助。

1 发病情况调查

2018年7月，接贵州地区某县动物疫病预防控制中心反映，该县一黑毛猪养殖场饲养的猪经屠宰后发现身上长有许多肿大的淋巴结，多的甚至达到5 kg。初始认为是某寄生虫病引起的皮肤病，但对病猪用驱虫药进行治疗观察10 d以上未见效果，其发病越显严重，请求送检实验室以得到确诊。

经现场实地检查，该猪场存栏有190余头杂交黑毛猪，猪群引进时就发现部分猪就有少许皮肤疱疹，在饲养过程中发现同舍的其他猪也逐步发病，皮肤疱疹发生面积逐步扩大，持续时间有10余个月，中间未发生过其他的疫（疾）病情况。

发病猪只均为育成肥猪，排查有临床症状的患猪有30余头，临床发病率为15.79%。患猪精神状况良好，饮食、粪便正常，全身皮肤均患有不同程度的局灶性皮炎，主要分布在颈部、前胛、下腹、四肢、臀部等皮肤上（如图1、图2、图3所示部位）。用手触摸患部皮下浅表处，有乒乓球到网球大小的硬性炎性结节，边缘清晰，触压痛性不明显。将病猪屠宰后检查发现，肌肉与皮肤边缘处见淋巴结肿大，呈大小不等的圆形包块，病变组织切面呈边缘规则的圆形或椭圆形坏死灶，内有大量的乳白色干酪样炎性分泌沉积物（如图4所示部位），其他脏器及组织未见异常。

2 PCR检测

2.1 试验材料及方法

2.1.1 试验材料

检测样品为从发病猪场采集的猪淋巴结、肺病料组织；DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/µL）、TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、无水乙醇等均为国产试剂。

2.2.2 总DNA提取

分别取淋巴结、肺病组织样品加入适量的PBS溶液研磨成浆，取上清，参照TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取的DNA于-20 ℃保存。

图1 前后肢皮肤炎性结节

图2 后肢体前侧肤炎性结节

图3 臀部皮肤炎性结节

图4 皮下肌肉淋巴结坏死灶

2.2.3 引物设计

猪圆环病毒基因特异性引物：根据GenBank中登录的PCV2全基因序列(KX898030) 高度保守区域，利用Primer 6.0 软件设计特异性引物 A1/A2 (5′-TTCCATG GAGGTCTGTAG G-3′/5′-GAATGGATTGCCACTCG G-3′)， 预 期 扩 增 片 目 的 片 段 为353 bp。引物由上海宝生物公司合成。

猪伪结核棒状杆菌基因特异性引物：参照Çetinkaya等设计的伪结核棒状杆菌16S rRNA引物(P1：5′-ACCGCACTTTAGTGTGTGT G-3′；5′ -P2：TCTCTAC GCCG ATCTTGTAT-3′)进行PCR扩增，预期扩增片目的片段为778 bp。引物由上海宝生物公司合成。

2.2.4 反应体系

猪圆环病毒反应体系为：以DNA为模板，PCR反应液16 μL，TaqDNA聚 合 酶 2 μL， 模 板DNA 2 μL。反应条件为：94 ℃ ，3 min ；94 ℃ ，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃， 45 s，共 35次；72 ℃延伸10 min。

猪伪结核棒状杆菌反应体系为：以DNA为模板，PCR反应体系为25 μL：Taq DNA 聚合酶0.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物 P1、P2各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，无菌水 17 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。

3 检测诊断结果

从图5结果显示，送检样品中均检出圆环病毒特异性片段；从图6结果显示，待检病理组织样品均未检出伪结核棒状杆菌特异性片段。采集的发病猪病料组织样品PCR病原核酸检测结果为圆环病毒病原核酸检测为感染阳性，目的片段 353 bp；伪结核棒状杆菌病原核酸检测为阴性。本次发生的疫病确诊为猪圆环病毒感染。

4 结论与分析

在贵州地区，以黑毛猪为代表的地方品种猪群发生皮肤型为主的圆环病毒病感染在生产上实则较为少见。该病案呈现的猪皮下浅表淋巴结肿大、化脓性炎症病变、发病情况以及其他临床表征，均与猪伪结核棒状杆菌感染极其相似，在临床上难以区别，故PCR病原核酸检测时与猪伪结核棒状杆菌感染进行了鉴别诊断。因此，一旦猪群发生类似的疾病，建议应尽早送实验室进行检测诊断，不要耽误疫病最佳的治疗时间，为疫病的早期防控提供参考依据。

在畜禽养殖生产中，猪圆环病毒病感染为一种重要的猪免疫抑制性疫病，其高度的免疫抑制危害将对其他疫病的免疫防控带来重要影响。因此，在对地方猪品种资源的收集、保护、开发与利用中，建议加大对猪圆环病毒病的检测与净化工作，避免该病在地方猪品种间的感染与传播。

图5 猪圆环病毒扩增图

图6 猪伪结核棒状杆菌扩增图